基于荧光素酶的检测法在人胚胎肾细胞中评估抗病毒化合物

摘要

来源：Lucas-Hourani, M. 等.，RNA病毒广谱化学抑制剂的高通量筛选。J. Vis. Exp. (2014)

本视频展示了一种基于荧光素酶的抗病毒检测方法，该方法使用感染了重组麻疹病毒的人胚胎肾细胞。结果显示，系列稀释的待测化合物可抑制病毒复制，导致发光强度呈剂量依赖性降低，同时维持宿主细胞的活力。

方案

1. 表达萤光素酶的麻疹病毒（rMV2/Luc）感染细胞培养物的制备

1. 在含稳定化 L-谷氨酰胺并补充 10% 胎牛血清（FCS）、链霉素（100 μg/ml）和青霉素（100 IU/ml）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养 HEK-293T 细胞。每 4–5 天通过胰酶消化传代细胞，并以 1:10 比例转接至新培养瓶中。实验时细胞应处于对数生长期。
2. 实验当天，通过胰酶消化收集细胞并进行细胞计数。离心沉淀细胞后，以 3 × 10⁵ 个细胞/ml 的密度重悬于培养基中。请注意，每块筛选板需要 12.5 ml 细胞悬液。
3. 再次将细胞以 3 × 10⁵ 个细胞/ml 的密度重悬于培养基中。请注意，每块筛选板需要 12.5 ml 细胞悬液。
4. 可选：在培养基中添加 20 μg/ml 尿苷。
   注意：在筛选病毒复制抑制剂的化合物文库时，常会分离到靶向嘧啶生物合成途径早期步骤的化合物。向培养基中添加尿苷可用于排除此类抗病毒分子。事实上，当嘧啶生物合成途径上游酶被抑制时，添加尿苷可有效恢复病毒复制。
5. 保留 1/10 体积的细胞悬液用于未感染细胞的对照孔，其余部分用于感染操作。
6. 解冻适量的 rMV2/Luc 储存液。麻疹病毒（MV）储存液浓度通常为每毫升 10⁶–10⁸ 个感染性颗粒。每靶细胞需接种 0.1 个 rMV2/Luc 感染性颗粒，即感染复数（MOI）为 0.1。 
   注意： rMV2/Luc 源自麻疹疫苗（Schwarz 株），应在 BSL2 环境中操作。
7. 将病毒加入细胞悬液中并轻轻混匀。将感染后的细胞转移至储液槽中，并向含有添加化合物的 D2 板第 2 至第 11 列各孔中分配 100 μl 感染细胞悬液。储液槽中的细胞悬液需定期轻轻混匀。
8. 向第 1 和第 12 列各孔中分配 100 μl 未感染细胞。其余孔中分配感染细胞。
9. 于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育细胞 24 小时。

2. 毒性与广谱抗病毒活性的二次筛选

1. 在二甲基亚砜（DMSO）中对每种命中化合物进行1:2系列稀释，起始浓度为500 µM至4 µM（共8个稀释度）。向白色条码组织培养板中加入50 µl培养基。向各培养孔中加入1 µl每种化合物稀释液。重复两次，使每种命中化合物获得3块含有重复系列稀释液的培养板。
2. 按照上述方法（1.1和1.2节）制备37.5 ml浓度为6 × 10⁵ 个细胞/ml的HEK-293T细胞悬液。将细胞悬液分装至Falcon管中，每管12.5 ml，共两管，分别用rMV2/Luc（MOI = 0.1）或表达海肾荧光素酶的重组基孔肯雅病毒（CHIKV/Ren）（MOI = 0.2）感染细胞。通过倒置混匀。
   注意：CHIKV/Ren来源于CHIKV的野生型毒株，因此应在BSL3级生物安全条件下操作。一旦向培养孔中加入海肾荧光素酶底物后（见下文），培养板即可从BSL3转移至BSL1级环境。
3. 向含有命中化合物系列稀释液的培养板中每孔加入50 µl未感染、rMV2/Luc感染或CHIKV/Ren感染的细胞悬液。在37 °C孵育24小时。
4. 向rMV2/Luc感染的孔中加入50 µl萤火虫荧光素酶底物，以检测萤火虫荧光素酶活性。向CHIKV/Ren感染的孔中加入50 µl海肾荧光素酶底物，以检测海肾荧光素酶活性。最后，向未感染的细胞孔中加入50 µl基于荧光素酶的细胞活力检测试剂，以测定细胞活力。
5. 绘制数据图（图1），确定可抑制MV和CHIKV复制50%的命中化合物浓度。排除在此检测中显示一定毒性的化合物。

结果

图1. 化合物C864、C648和C062的剂量反应性抗病毒活性及毒性。（A）HEK-293T细胞感染表达荧光素酶的麻疹病毒rMV2/Luc株（MOI=0.1），并用递增剂量的C864、C648、C062或单独DMSO处理。24小时后检测荧光素酶表达水平。*表示三种化合物观察到的荧光素酶抑制作用均具有统计学显著性（p值 < 0.05）。（B）HEK-293T细胞感染表达海肾荧光素酶的基孔肯雅病毒CHIKV/Ren株（MOI=0.2），并用递增剂量的C864、C648、C062或单独DMSO处理。24小时后检测海肾荧光素酶表达水平。*表示三种化合物的抑制作用均具有统计学显著性（p值 < 0.05）。（C）HEK-293T细胞用递增剂量的C864、C648、C062或单独DMSO处理。作为毒性对照，细胞培养物中加入2.5 μl的0.5% IGEPAL溶液。24小时后，使用基于荧光素酶的细胞活力检测法测定活细胞数量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Freedom EVO 平台	TECAN		自动化机器人平台
96 孔白色聚苯乙烯细胞培养微孔板	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo 发光法细胞活力检测试剂盒	Promega	G7570	基于荧光素酶的细胞活力检测
Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统	Promega	E2610	含萤火虫荧光素酶底物的试剂
Renilla-Glo 荧光素酶检测试剂系统	Promega	E2710	含海肾荧光素酶底物的试剂
Britelite plus 报告基因检测试剂系统	Perkin-Elmer	6016761	含萤火虫荧光素酶底物的试剂。可作为 Bright-Glo 试剂的替代品用于检测荧光素酶活性。