使用阿米巴原虫从混合病毒群中分离单一巨型病毒

摘要

来源：Sahmi-Bounsiar, D. 等. 单细胞微吸法作为荧光激活细胞分选的替代策略用于巨型病毒混合物的分离。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用单细胞微吸法，以阿米巴原虫作为宿主细胞，从混合病毒群中分离并扩增单一巨型病毒种群。

方案

1. 阿米巴培养

1. 使用Vermamoeba vermiformis（菌株 CDC19）作为细胞载体。
2. 在 75 cm² 的细胞培养瓶中加入 30 mL 蛋白酶-蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培养基（PYG）（表 1）以及 3 mL 浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的阿米巴原虫。
3. 将培养物置于 28 °C 条件下培养。
4. 48 小时后，使用计数板对阿米巴原虫进行定量。
5. 洗涤时，收集浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的细胞，并在 720 × g 离心 10 分钟使阿米巴原虫沉淀。弃去上清液，用适量饥饿培养基重悬沉淀，获得浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的悬液（表 1）。

2. 终点稀释

1. 用饥饿培养基（表1）对病毒样品进行连续稀释（10^-1 至 10^-11）。
2. 在每个培养皿中加入 100 µL 混合接种物，接种 2 mL 浓度为 1 × 10⁶ 的 Vermamoeba vermiformis。
3. 将培养皿置于可密封的塑料袋中，在 30 °C 条件下培养。
4. 感染后 6 小时开始使用倒置光学显微镜观察培养皿，并每隔 4 至 8 小时检查一次细胞形态。
5. 当出现以细胞变圆为特征的细胞病变效应时，开始进行单细胞微吸管分离操作。

3. 单细胞微吸法

1. 准备宿主细胞
   注意：此步骤旨在将感染的单个细胞转移至新鲜的细胞培养基中。
   1. 使用含有 10 µg/mL 万古霉素、10 µg/mL 亚胺培南、20 µg/mL 环丙沙星、20 µg/mL 多西环素和 20 µg/mL 伏立康唑的抗菌剂处理培养中的阿米巴原虫，以防止细菌和真菌污染。
      注意：该操作在生物安全柜外的实验台上进行。将浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的阿米巴原虫各 2 mL 分别加入 15 个培养皿中。为促进阿米巴附着，于 30 °C 培养 30 分钟。
2. 根据以下标准，从有限稀释实验中选择用于显微穿刺操作的培养皿：1）无真菌或细菌污染的可见迹象；2）阿米巴细胞出现由病毒感染导致的细胞病变效应；3）阿米巴处于裂解前期并呈圆形（以避免吸入病毒颗粒）。
3. 设置配备以下材料的工作站（图 1A,B）：显微操作仪，用于精确定位微毛细管；手动压力控制装置，用于将细胞吸入和释放出微毛细管；倒置显微镜；即插即用电机模块；相机；用于观察操作过程并拍摄图像的计算机模块。
4. 选择合适的微毛细管（图 1C）。
   注意：细胞大小、细胞膜对表面的变形与黏附能力以及细胞运动性均可能影响显微穿刺的顺利进行。可根据细胞类型的具体尺寸和穿刺方法精确选择并调整微毛细管的直径。本实验中采用内径为 20 µm 的微毛细管来吸取一个呈圆形的阿米巴细胞（直径约 10 µm），这有助于细胞在毛细管内保持稳定位置并便于后续释放。
5. 安装系统。
   1. 将夹持系统的操作角度在电机模块上固定为 45°。
   2. 进行双重安装，先安装夹持系统，再安装微毛细管。
   3. 通过微毛细管滴加少量油后对细胞进行聚焦。
      注意：设备提供的矿物油具有生物学相容性。
   4. 按照制造商的建议完成安装。
6. 克隆细胞（图 2A,B）
   1. 将含有 2 mL 感染阿米巴的培养皿置于显微镜下。
   2. 首先对细胞进行聚焦，然后对浸入培养液中的微毛细管进行聚焦。
   3. 选取一个呈圆形的单个细胞，并将微毛细管靠近该细胞。
   4. 通过手动压力控制装置轻柔地对细胞施加负压，将其吸入微毛细管内。将该单个细胞从原始样本中移出，并释放至新的细胞培养基中，随后于 30 °C 培养。
   5. 每天使用倒置光学显微镜进行观察，记录细胞形态变化，并监测细胞病变效应的出现情况。

表1：培养基成分

结果

图1：显微操作所需材料。（A）工作站的实际装置。（B）工作站组件的示意图。（C）微毛细管的示意图。

图2：显微吸吮步骤。（A）单细胞分离流程（40倍放大）。（B）单细胞吸吮各步骤的示意图：1）细胞定位；2）细胞吸吮；3）释放步骤。黑色箭头指示微毛细管，白色箭头指示单个细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning 细胞培养瓶 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	培养
Corning 细胞培养瓶 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	培养
Corning 细胞培养瓶 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	培养
DFC 425C 相机	LEICA	Unkown	观察/监测
Eclipse TE2000-S 倒置显微镜	Nikon	Unkown	观察/监测
20 µm 微毛细管	Eppendorf	5175 107.004	细胞微吸与释放
显微操作仪 InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	微毛细管定位
35 mm 培养皿	Ibidi	81158	培养/观察