基于荧光的单个病毒颗粒分选用于基因组分析

摘要

来源：Zeigler Allen, L., et al. 利用“单病毒基因组学”进行单个病毒颗粒的分离与基因组分析。J. Vis. Exp. (2013)。

本视频展示了如何利用流式细胞术通过基于荧光的检测和精确的颗粒分选，从混合的病毒群体中分离出含有基因组的单个病毒，并通过琼脂糖包埋以进行后续的基因组表征。

方案

1. 病毒悬液的制备

在通过流式细胞术分离单个病毒颗粒之前，制备未固定的病毒悬液。

1. 使用已建立的实验方案分离病毒颗粒，确保最终病毒悬液保存在0.1 μm滤膜过滤的TE缓冲液（Tris-EDTA，pH 8）中。推荐采用切向流过滤（TFF）方法，尽管也已开发出使用化学絮凝的其他方法。
2. 使用已确立的实验方案对病毒颗粒进行计数，例如采用落射荧光显微技术8-10或流式细胞术。
3. 将病毒悬液分装至两个Eppendorf管中（建议最终体积为1,000 μl）。

2. 流式细胞术

1. 使用配备定制前向散射光电倍增管（FSC PMT）的 BD FACSAria II 流式细胞仪分选病毒时，将病毒颗粒稀释于 0.1 μm-过滤的TE缓冲液（pH 8.0）中，调整至适当滴度，使事件速率为200个事件/秒^-1.
2. 设置阈值以最大化信噪比，例如对于含有T4和λ噬菌体颗粒的混合样本，建议设置前向散射光PMT（FSC PMT）为1,000，侧向散射光（SSC）为200。
3. 运行 100 μl 的 "空白" 仅含 1）的样品 0.1 μm-过滤的TE和2） 0.1 μm-过滤的TE缓冲液和1×10⁻⁴稀释度的SybrGreen1（原液10,000倍稀释）
4. 取少量等分试样（建议100 μl）100 μl 建议取未染色病毒悬液的小份样品进行检测以评估背景信号，随后检测染色病毒悬液（SYBR Green1按原液1×10⁻⁴稀释），每种病毒悬液各收集总计5,000个事件。此步骤用于在分选前检查病毒浓度并根据需要调整分选门控。我们建议将门控范围设置在病毒颗粒群的中心区域且较为紧凑。此外，门控的设定基于SYBR Green与FSC PMT的散点图。
5. 添加 5 μl 1%低熔点（LMP）琼脂糖（溶于TBE缓冲液）冷却至 37 °C 到聚四氟乙烯（PTFE）显微镜载玻片（Electron Microscopy Sciences）的每个孔中。
6. 将聚四氟乙烯显微镜载玻片装入流式细胞仪，以捕获分选的病毒颗粒。
7. 开始将SYBR Green染色的病毒颗粒直接分选到含低熔点琼脂糖（LMP agarose）的PTFE载玻片上。我们建议在部分孔中分选10个或更多事件（病毒颗粒），以利于共聚焦激光扫描显微镜（CSLM）观察时对病毒深度的检测。
8. 分选完成后，将载玻片从流式细胞仪中取出，并向每个孔中加入 5 μl 更多冷却至 37 °C 的低熔点琼脂糖 37 °C 向每个孔中加入，从而包埋病毒颗粒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X TE 缓冲液	Invitrogen	12090-015
缓冲液饱和酚	Invitrogen	15513-039
LMP 琼脂糖	Invitrogen	16520100
PTFE 显微镜载片	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 孔，4 mm 直径
β-琼脂糖酶	New England Biolabs	M0392S