基于阿米巴的环境水样中巨型病毒富集方法

摘要

来源：Bou Khalil, J. Y.，等．利用Vermamoeba vermiformis从环境样本中快速分离新型福斯托病毒的策略．J. Vis. Exp. （2016）

本视频展示了利用基于阿米巴的共培养方法，从环境水样中富集巨型病毒，以实现后续的检测与分析。

方案

1. 样品采集

1. 从不同环境和区域采集 70 份样本。本实验中采用以下样本：来自法国圣皮埃尔德梅佐阿尔格村（Saint Pierre de Meyzoargues）的 5 份污水样本，来自法国马赛博雷利公园（Parc Borély）湖泊的 15 份样本，来自法国马赛萨梅纳（Samena）岩石港湾含沉积物的海水样本 15 份，来自法国阿尔卑斯山区河流的水样 25 份，以及来自法国拉西奥塔（La Ciotat）污水的样本 10 份。
2. 接种前将样本涡旋振荡混匀，室温下处理 1 分钟，不进行任何其他处理。

2. 分离步骤

1. 盲法培养程序与样品接种的宿主制备
   1. 使用 Vermamoeba vermiformis （菌株 CDC19）作为共培养的细胞载体。
   2. 将阿米巴原虫在 28 °C 条件下，置于含 30 ml 蛋白酶-蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培养基（PYG）的 75 cm² 细胞培养瓶中进行培养。请参见 表 1 查阅 PYG 的组成。
      注意： 培养 48 小时后，使用计数载玻片（如 Kovaslides）通过常规计数法对阿米巴原虫进行定量。
   3. 以 5 × 10⁵ 至 10⁶ 个细胞/ml 的浓度收集细胞，并在 720 × g 条件下离心 10 分钟，使阿米巴原虫形成沉淀。
   4. 通过抽吸去除上清液，并将阿米巴沉淀重悬于 30 ml 无菌 Page 阿米巴生理盐水（PAS）中，表 1。重复此洗涤步骤。
   5. 将阿米巴原虫重悬于 30 ml 含抗生素和抗真菌剂混合物的饥饿培养基中，浓度约为 10⁶ 个阿米巴原虫/ml。饥饿培养基是一种维持阿米巴存活的培养基，可使其在不形成包囊也不增殖的情况下保持活性。请参见 表 1 查阅其组成。
      注意： 抗微生物剂混合物包含 10 µg/ml 万古霉素、10 µg/ml 亚胺培南、20 µg/ml 环丙沙星、20 µg/ml 多西环素和 20 µg/ml 伏立康唑。该混合物用于减少可能抑制或改变病毒增殖的细菌和真菌污染。
   6. 将每份样品各 25 µl 直接接种至 96 孔板的平底孔中，每孔含有 200 µl 阿米巴单层细胞，以利于阿米巴附着，并在湿润环境中 30 °C 培养（湿润环境指将浸湿的敷料置于盛放培养板的袋内，以避免蒸发）。此为初代培养。保留两个孔不接种任何样品，作为空白对照。将此初代培养物培养三天。
   7. 首次接种三天后，将初代培养板按上述方法转接至新鲜阿米巴细胞上，无需进行显微镜观察。新培养板在与初代培养相同的条件下继续培养三天。
   8. 上述三天培养结束后，按照初代和传代培养相同的方法进行终末培养。将终末培养物继续培养两天，随后进行检测。

表1. 溶液配方

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖（PYG）培养基，Page氏阿米巴生理盐水（PAS），饥饿培养基	实验室自制	马赛 URMITE	x
阿米巴菌株 CDC-19	ATCC	法国	50237
培养板	Cellstar	法国	655180
培养瓶	SARSTEDT	德国	833911
超速离心机 Sorval WX 80	Thermo scientific	法国	9102448