通过荧光显微镜定量感染性丙型肝炎病毒

摘要

来源：Ren, S., 等. 丙型肝炎病毒复制分析方案. J. Vis. Exp. (2014)

本视频展示了用于定量细胞培养中感染性丙型肝炎病毒的荧光灶点检测法。该方法演示了病毒上清液的连续稀释、肝癌细胞的感染，以及利用基于抗体的荧光显微镜检测病毒复制位点。

方案

1. 测定病毒滴度

1. 将 naive Huh-7.5.1 细胞以每孔约 3 x 10³ 个细胞的密度接种于 96 孔板中。³ 每孔约3 × 10³个细胞接种于96孔板中。次日，用培养基对从丙型肝炎病毒（HCV）RNA转染细胞中收集的无细胞培养上清液进行10倍系列稀释，并将各稀释液以每组三个复孔接种至Huh-7.5.1细胞。
2. 感染后72小时，使用甲醇固定细胞（-20 °C下放置30分钟）。 ºC）并对HCV NS5A蛋白进行免疫染色。
3. 用 PBS 洗涤细胞三次，然后用 IFA 封闭缓冲液封闭。
4. 使用兔多克隆抗-NS5A一抗或小鼠单克隆抗-dsRNA抗体J2，按1:200稀释（1 μg/ml并在 4℃ 孵育 5 小时至过夜 ºC.
5. 一抗孵育后，用 PBS 洗涤细胞三次。
6. 加入羊抗兔IgG-488多克隆二抗或羊抗鼠IgG-594多克隆二抗，稀释比例为1:1,000（1 μg/ml孵育1小时，室温。
7. 用 PBS 清洗细胞三次，然后使用荧光显微镜观察。
8. 使用最高稀释度计数 NS5A 阳性病灶，并计算每毫升中成焦点单位（focus-forming unit, FFU）的平均数量。参见 图1 用于HCV滴度测定。

结果

图1. 检测野生型HCV的感染性并测定病毒滴度。A) 采用 naive Huh-7.5.1 细胞进行感染实验。将转染HCV RNA后48小时和96小时（hpt）收集的无细胞上清液进行10倍系列稀释，并以每组三个复孔的方式加入96孔板中的细胞。感染72小时后，固定细胞并针对HCV NS5A蛋白进行免疫染色。NS5A阳性染色（红色）的细胞表示已被病毒感染。在测定焦点形成单位（FFU）时，统计最高稀释度下的阳性焦点数量。图中显示代表性图像（比例尺：100 μm）。B) 图中显示每毫升焦点形成单位（FFU）的病毒滴度的平均值及标准差。聚合酶缺失突变体未产生具有感染性的病毒颗粒。WT：野生型；Pol-：聚合酶缺失型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		该细胞系由 Francis Chisari 博士通过 The Scripps Research Institute 与 Cedars-Sinai 医学中心之间的正式材料转让协议（MTA），慷慨提供给 Arumugaswami 博士
小鼠单克隆抗双链RNA抗体 J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020