来源：Kalveram, B. 等。利用点击化学检测病毒感染对宿主细胞RNA合成的影响。J. Vis. Exp. (2013)
本视频展示了利用点击化学和荧光显微镜技术在哺乳动物细胞中可视化新生RNA转录的过程。通过比较感染细胞与对照细胞之间的荧光信号，重点揭示了病毒感染如何抑制宿主细胞的转录活动。
方法文章
可视化病毒侵染细胞中的转录抑制现象
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2026年9月30日
本文内容
摘要
方案
用裂谷热病毒（RVFV）MP-12株感染细胞，并用5-乙炔基尿苷（EU）标记新生RNA
- 将人胚胎肾293（HEK293）细胞接种于6孔组织培养板中，培养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） 100 μg/mL 链霉素）。在湿润的培养箱中孵育 37 °C 和5% CO₂2 直至细胞达到 80 - 100% 汇合度。
- 以感染复数（MOI）为3的MP-12病毒感染细胞。设置至少两个未感染的孔，其中一个作为未感染对照，另一个用放线菌素D（ActD）处理。吸除培养基，稀释病毒原液，使加入每孔的总体积为 400 μL. 在湿润的培养箱中孵育1小时，温度为 37 °C 和 5% CO2.
- 移除接种液，每孔加入 2 mL 新鲜培养基。于 37 °C 12 小时
注意： 若将本方案用于其他病毒，建议进行时间进程实验，以确定标记和收获的最佳时间点。设置该时间进程实验时，应使感染时间错开，以便所有样品可在同一时间进行标记、收获和染色。
- 感染后12小时（hpi），将培养基更换为含有0.5 mM EU的培养基。向其中一个模拟感染孔中同时加入 5 μg/mL 放线菌素D（ActD）。这将作为转录抑制的对照，因为ActD可抑制依赖DNA的RNA合成。将细胞放回培养箱中。
- 在感染后13小时，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，并通过胰蛋白酶消化收获细胞。将收获的细胞用含有1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS洗涤三次。
注意： 在此步骤及后续步骤中，离心速度不得超过500–1,000 × g，以防止细胞破裂。离心1–2分钟以沉淀细胞。
注意： 如果计划在点击反应后进行表面免疫染色，则应使用橡胶刮棒或一次性细胞刮刀收集细胞。
- 将细胞重悬于1 mL 4%多聚甲醛（PFA）中，室温（RT）孵育30 min。
- 每孔用 1 mL PBS-EDTA 洗涤一次。立即进行步骤 2。
注意： 必须立即进行点击化学反应，因为RNA在此阶段长时间放置会降解。同样，若进行时间进程实验，务必同时对所有样品进行标记、固定和染色。
点击化学反应检测标记的RNA
- 加入1 ml含0.2% Triton X-100的PBS缓冲液，对细胞进行透化处理，在室温下孵育10分钟。
注意： 步骤 2.1 至 2.3 中使用的所有溶液均需无核酸酶。
- 每孔用 1 ml PBS 洗涤三次。
- 从12孔板中取出盖玻片并转移至湿盒中。每张盖玻片上覆盖50 - 100 μl 点击染色液（100 mM Tris pH 8.5，1 mM CuSO₄）4, 20 μM 荧光叠氮化物［激发/发射最大值：590/617 nm］，100 mM 抗坏血酸）。在室温避光孵育1小时。
注意： 组装湿化室时，将直径为10 cm的细胞培养皿或培养皿底部铺上一层塑料封口膜，在培养皿边缘内侧铺上湿润的纸巾，然后将盖玻片放置在塑料封口膜上。
注意： 在整个实验步骤中，务必注意防止盖玻片干燥。将盖玻片放入湿盒后，应立即在其上直接加入染色液为宜。
注意： 在进行此步骤前立即新鲜配制点击染色液。1.5 M Tris pH 8.5 和 100 mM CuSO₄ 的储存液4，500 mM 抗坏血酸可保存于 4 °C然而，若抗坏血酸储存液变黄，则应弃用。
注意： 务必选择与荧光显微镜滤光片相匹配的荧光染料。
- 将盖玻片从湿盒中取出，放入新的12孔板中，每孔加入1 ml PBS洗涤三次。
- 用一滴（约 15 μl) 将 Fluoromount-G 滴加到显微镜载玻片上。将盖玻片浸入 H2O，去除过量 H2用纸巾轻触侧面以去除多余液体，将细胞面朝下放入 Fluoromount-G 滴中，室温晾干 5 分钟。
注意： 若在倒置显微镜上成像，需让 Fluoromount-G 在室温下凝固 4 °C 过夜，或用透明指甲油密封盖玻片边缘，将其固定在显微镜载玻片上。
注意： 载玻片可立即成像或储存于 4 °C 在避光条件下最长可保存一周。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-乙炔基尿苷 | Berry Associates | PY 7563 | 溶于DMSO配制成100 mM储备液 |
| 12 mm圆形盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 放线菌素D（ActD） | Sigma | 9415 | 溶于DMSO配制成10 mM储备液 |
| 荧光显微镜 | 例如Olympus IX71 | ||
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | 溶于H₂O配制成100 mM储备液 |
| DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基） | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS（胎牛血清） | Invitrogen | 16000044 | |
| 荧光叠氮化物（Alexa Fluor 594偶联） | Invitrogen | A10270 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A-5960 | 溶于H₂O配制成500 mM溶液 |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Trizma碱 | Sigma | T-1503 | 溶于H₂O配制成1.5 M储备液，pH 8.5 |
