来源：Kalveram, B., et al. 利用点击化学测量病毒感染对宿主细胞RNA合成的影响。J. Vis. Exp. (2013)
本视频演示了如何利用点击化学和流式细胞术来检测病毒感染对宿主细胞转录的抑制作用。用表达核致病蛋白的病毒感染哺乳动物细胞，该蛋白可破坏宿主转录因子复合物，而对照组细胞则保持转录活性。通过掺入5-乙炔基尿苷对新合成的mRNA进行标记，从而利用双荧光检测方法对感染细胞和对照细胞中的转录活性进行定量分析。
方法文章
利用流式细胞术分析病毒诱导的宿主转录抑制
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2026年9月30日
本文内容
摘要
方案
1. 用 MP-12 感染细胞并用 5-乙炔基尿苷 (EU) 标记新生 RNA
- 将293细胞以生长培养基（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM）接种至6孔组织培养板中。在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育，直至细胞达到80–100%汇合度。
- 以感染复数（m.o.i.）为3的MP-12病毒感染细胞。至少设置两个未感染的对照孔：其中一个作为未感染对照，另一个将在步骤1.4中用放线菌素D（ActD）处理。吸除生长培养基，稀释病毒原液，使每孔加入的总体积为400 μl。在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育1小时。
- 移除接种液，每孔加入2 ml新鲜生长培养基。在37 °C继续孵育12小时。
注意：如果将本方案改编用于其他病毒，建议进行时间进程实验，以确定标记和收获的最佳时间点。设置该时间进程实验时，应使感染时间错开，以便所有样品可在同一时间进行标记、收获和染色。
- 在感染后12小时，将培养基更换为含有0.5 mM EU的培养基。向其中一个模拟感染孔中加入5 μg/ml的放线菌素D（ActD），作为转录抑制的对照，因为ActD可抑制依赖DNA的RNA合成。将细胞放回培养箱中继续培养。
- 在感染后13小时，用PBS洗涤细胞一次，通过胰酶消化法收集细胞。用含有1 mM EDTA的PBS（PBS-EDTA）对收集的细胞洗涤三次。
注意：在此步骤及后续步骤中，离心速度不得超过 500 - 1,000 ×g，以防止细胞破裂。离心 1-2 分钟以沉淀细胞。
注意：如果在点击化学反应后计划进行表面免疫染色，请使用橡胶刮棒或一次性细胞刮刀收集细胞。
- 用 1 ml 4% 多聚甲醛重悬细胞以固定细胞，在室温下孵育 30 分钟。
- 每孔用 1 ml PBS-EDTA 洗涤一次。立即进入步骤 6。
注意：必须立即进行点击化学反应，因为RNA在此阶段长时间放置会降解。同样，如果进行时间进程实验，务必同时对所有样品进行标记、固定和染色。
2. 检测标记RNA的点击反应
- 用 0.5 ml 含 0.2% Triton X-100 的 PBS 重悬细胞以进行透化处理，在室温下孵育 10 分钟。
注意：步骤 2.1 至 2.3 中使用的所有溶液均需为无核酸酶的。如果细胞在此步骤中沉淀不充分，可将离心时间延长至 5 分钟。一旦细胞悬浮于 FACS 缓冲液中，沉淀行为将得到改善。
- 用 1 ml PBS 洗涤一次。
注意：此步骤中请勿使用EDTA，因为它会螯合点击反应所必需的Cu²⁺离子。
- 将细胞重悬于 200 μl 点击染色液（100 mM Tris pH 8.5，1 mM CuSO4，200 nM 偶氮化荧光染料标记物 [激发/发射最大值：650/665 nm]，100 mM 抗坏血酸）中。室温避光孵育 1 小时。
注意：请在此步骤前立即新鲜配制点击化学染色液。1.5 M Tris（pH 8.5）、100 mM CuSO4 和 500 mM 抗坏血酸的储存液可保存在 4 °C。然而，若抗坏血酸储存液变为黄色，则应弃用。若在此步骤中细胞发生聚集，请通过反复吹打重新悬浮细胞。务必选择一种可被流式细胞仪检测的荧光染料。同时准备一份未经点击化学染色处理的感染细胞样品，用于流式细胞仪的校准。可在第 1.2 步中使用一半感染细胞，或额外设置一个感染孔。
用FACS缓冲液（含1 mM EDTA和0.5% (w/v) BSA的PBS）洗涤两次。
3. 检测病毒蛋白表达的免疫荧光法
- 用 200 μl FACS 缓冲液（1:10,000 稀释的抗 RVFV 一抗）重悬细胞，在室温避光孵育 1 小时。
注意：或者，此步骤也可在 4 °C 避光条件下过夜（O/N）进行。
注意：还需准备一份未感染细胞的样品，该样品需经过点击化学染色步骤但不进行免疫染色，用于流式细胞仪的校准。可在第1.2步中使用一半的模拟感染细胞，或额外设置一个未感染的孔。
注意：在将本方案用于其他病毒时，应首先确定一抗的最佳稀释度。
- 用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。
- 将细胞重悬于 200 μl 二次抗体（与荧光染料偶联的抗小鼠 IgG [激发/发射最大值：495/519 nm]）中，该抗体用 FACS 缓冲液按 1:1,000 稀释，于室温避光孵育 1 小时。
- 用 FACS 缓冲液洗涤细胞一次。
注意：此时，细胞可在 4 °C 避光条件下保存过夜。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-乙炔基尿苷 | Berry Associates | PY 7563 | 溶于DMSO配制成100 mM储备液 |
| 12 mm圆形盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml聚苯乙烯管 | BD Biosciences | 352058 | |
| 放线菌素D（ActD） | Sigma | 9415 | 溶于DMSO配制成10 mM储备液 |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | 溶于H2O配制成100 mM储备液 |
| DAPI | Sigma | D-9542 | 溶于H2O配制成5 mg/ml储备液 |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| 荧光叠氮化物（Alexa Fluor 594偶联） | Invitrogen | A10270 | |
| 荧光叠氮化物（Alexa Fluor 657偶联） | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A-5960 | 溶于H2O配制成500 mM溶液 |
| 滤纸 | VWRbrand | 28333-087 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 聚-L-赖氨酸（分子量 ≥ 70000） | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma碱 | Sigma | T-1503 | 溶于H2O配制成1.5 M储备液，pH 8.5 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 荧光显微镜 | 例如Olympus IX71 | ||
| 流式细胞仪 | 例如BD Biosciences LSRII Fortessa |
