用于基因转移的逆转录病毒颗粒的制备

摘要

来源： Zjablovskaja, P., 等小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了通过转染人肾源性包装细胞来生产重组逆转录病毒颗粒的过程，从而实现将基因稳定递送至靶细胞，用于后续应用，如基因修饰、功能检测或谱系分化研究。

方案

1. 逆转录病毒的制备
   1. 将Bosc23细胞的单细胞悬液（6 × 10⁶）接种于16 cm培养皿中，加入18 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）进行培养，直至细胞融合度达到80%（24 h）。
      注意：细胞应呈单层生长，不应在培养过程中形成团块。细胞计数可采用多种方法（适用于本文所述其余实验方案）。若样本数量较少，建议使用Bürker计数板在显微镜下进行人工计数。此情况下，使用台盼蓝排除死细胞。将细胞与0.4%台盼蓝PBS（磷酸盐缓冲液）按1:1比例混合。若需对大量样本进行计数，可使用自动细胞计数仪。
   2. 将40 µg逆转录病毒载体（如MSCV）、20 µg pCL-Eco（包装质粒）、80 µl PEI（聚乙烯亚胺）以及2 mL无抗生素的低血清培养基（如Opti-MEM（最低必需培养基））混合。室温（RT）孵育20分钟。
   3. 小心地将Bosc23细胞的培养基更换为16 mL含2% FBS的DMEM。使用前将培养基预热至37 °C。
      注意：转染过程中不得使用抗生素，因其可能降低转染效率。
   4. 将步骤1.2中制备的混合液逐滴、轻柔地加入Bosc23细胞培养物中，于37 °C孵育4小时。由于PEI具有毒性，孵育时间不得超过6小时。
   5. 孵育结束后，将Bosc23细胞的培养基更换为18 mL预热的含10% FBS的DMEM，于37 °C继续培养48小时。将培养皿置于生物安全二级实验室中，并遵循标准安全操作规程。
   6. 使用25 mL移液管收集含有嗜异嗜性逆转录病毒颗粒的Bosc23细胞培养上清液，转移至50 mL离心管中，于4 °C保存。
      注意：（重要）转染效率应达到90%，以获得高滴度病毒。
   7. 向Bosc23细胞中加入18 mL预热的含10% FBS的DMEM，继续培养24小时。
   8. 重复步骤1.6。
      注意：当步骤1.6和1.8收集的逆转录病毒上清液温度一致（4 °C）后，可将其合并，以保持病毒完整性。
   9. 为避免病毒上清液中混入Bosc23细胞污染，将收集的病毒在4 °C下以1500 × g离心10分钟。分装病毒，使用干冰或液氮速冻，并于-80 °C保存。但需注意，新鲜制备的病毒在感染效率方面优于冻存病毒。
      注意：（重要）避免病毒反复冻融，因其会导致病毒降解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM（最低必需培养基）—低血清培养基	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-谷氨酰胺，酚红
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	用于培养 HEK293T、NIH3T3、BOSC23 细胞
青霉素	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
链霉素	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	硫酸链霉素粉末
庆大霉素	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
聚乙烯亚胺	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	线性，分子量 25,000（PEI 25000）