利用T7表达系统生成GFP标记的重组呼吸道合胞病毒

本文内容

摘要

来源：Bouillier, C. et. al.，重组呼吸道合胞病毒的扩增与滴定。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用基于T7的反向遗传学系统，生成表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组呼吸道合胞病毒的方法。共转染编码病毒蛋白的质粒与带有GFP标签的病毒基因组，可实现蛋白表达并启动病毒拯救。

方案

1. 重组病毒的拯救与首次传代

注意：所有以下步骤均须在无菌环境中使用II级生物安全柜进行。

转染前一天，在完全培养基中制备浓度为 5 x 10⁵ 个细胞/mL 的 BSRT7/5 细胞悬液。每孔加入 2 mL 细胞悬液至 6 孔板中。为每种待拯救的病毒准备一孔，另加一孔作为阴性对照。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。次日检查细胞融合度是否达到 80%–90%。
解冻反向遗传学呼吸道合胞病毒（RSV）载体 p-RSV-GFP 和 p-RSV-M2-1-GFP，以及 p-N、p-P、p-L 和 p-M2-1。为每种待拯救的病毒，在同一离心管中混合 p-N 和 p-P 各 1 µg、p-L 0.5 µg、p-M2-1 0.25 µg，以及 p-RSV（GFP 或 M2-1 GFP）1.25 µg。
注意： 可使用聚合酶复合物病毒蛋白（N、P、L 和 M2-1）的不同表达载体；但必须保持各蛋白之间的比例。通过将 p-RSV 载体替换为空载体来进行阴性对照实验。
进行转染（参见材料表）。
1. 向混合的载体中加入 250 µL 低血清培养基。在另一离心管中，将 10 µL 转染试剂加入 250 µL 低血清培养基中稀释。轻轻涡旋混匀两管，静置 5 分钟。将两管内容物混合，室温孵育 20 分钟。
2. 用 1 mL 低血清培养基冲洗 BSRT7/5 细胞，每孔加入含 10% 胎牛血清（FCS）且不含抗生素的 1.5 mL 最低必需培养基（MEM）。如有需要，置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育，直至完成步骤 1.3.1 所述的 20 分钟孵育。
3. 当步骤 1.3.1 的 20 分钟孵育结束后，向每孔加入 500 µL 上述转染混合液。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养 3 天。转染期间不要更换培养基。
每天使用倒置荧光显微镜在 20 倍放大下，通过 GFP 滤光片观察绿色荧光蛋白（GFP）荧光（激发波长 488 nm，发射波长 515–535 nm），以监测病毒拯救效率。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
BSRT7/5		不提供商业购买	参见参考文献22. Buchholz 等, 1999
用于观察的荧光显微镜	Olympus	IX73 Olympus 显微镜
用于视频显微成像的荧光显微镜	Olympus	ScanR Olympus 显微镜
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-谷氨酰胺 (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Lipofactamine 2000 试剂	ThermoFisher Scientific	11668019	第 2.3 步中的实验方案已针对该试剂优化
MEM (10x)，不含谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM，含 GlutaMAX 补充剂	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I 低血清培养基	ThermoFisher Scientific	51985-026
质粒		不提供商业购买	参见参考文献21. Rameix-Welti 等, 2014