感染性呼吸道合胞病毒的蚀斑滴定法

摘要

来源：Bouillier, C., et al. 重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定。 J. Vis. Exp. (2019)

该视频演示了一种空斑滴定实验，用于定量上皮细胞单层中的感染性重组呼吸道合胞病毒（RSV）。实验包括用系列稀释的病毒悬液感染宿主细胞，通过基于纤维素的半固体覆盖层限制病毒扩散，以及由细胞病变效应形成局部空斑。该操作流程最后通过染色、去污处理和空斑计数，以确定病毒滴度并评估RSV的感染能力。

方案

1. 空斑滴定实验

1. 在进行滴定实验的前一天准备12孔板（每管病毒滴定需要6个孔）。在每个孔中接种1 mL人上皮2型（HEp-2）细胞，浓度为5×10⁵ cells/mL。 × 10⁵ 细胞/mL，使用完全培养基。
2. 次日，制备无菌的微晶纤维素悬浮液（2.4% [w/v] 水溶液）（见材料表）。
   1. 将2.4 g微晶纤维素粉末加入100 mL蒸馏水中，使用标准磁力搅拌器搅拌，直至粉末完全溶解（通常需4–12 h）。将悬浮液在高压灭菌器中灭菌 121 °C 20分钟，并在使用前于室温下保存。
      注意： 在这些条件下，该悬液可稳定保存1年。
   2. 在无菌环境中打开溶液后，将其储存于 4 °C 6个月。使用前务必混合悬浮液（手动振荡或涡旋），以确保其均匀。
3. 制备 2× 最低必需培养基（MEM），在无菌环境中操作。将市售 MEM 稀释 10 倍× 用无菌水溶解，并加入L-谷氨酰胺、1,000单位/毫升青霉素和1毫克/毫升链霉素。剧烈振荡混匀后，于 4 °C.
   注意： 在II级生物安全柜中的无菌环境下进行步骤1.4–1.10。
4. 准备六个含有 900 µL 不含胎牛血清（FCS）的MEM培养基，每种待测病毒对应一支滴定管。解冻病毒分装样本，剧烈涡旋振荡5秒，然后转移 100 µL 加入第一支滴定管中。
5. 进行十倍梯度稀释6次×，如下所述。加入 100 μL 病毒的量 900 μL 在第一个试管中加入适量培养基，盖上管盖，涡旋振荡数秒以混匀内容物。更换移液器吸头，加入 100 µL 第一次稀释的 900 µL 在第二个试管中加入适量培养基，盖上管盖，涡旋混匀。重复该步骤至第六个试管。
   注意： 每次稀释时更换枪头非常重要。
6. 在 HEp-2 12 孔板上标记病毒名称及稀释倍数。对培养板及其盖子做匹配标记，以防染色过程中（步骤 1.9）发生混淆。吸除孔内培养基，并加入稀释后的病毒液 400 µL 每孔加入一个稀释度的样品。将培养板置于 37 °C 孵育2小时，用于病毒吸附。
   注意： 每次更换接种物时更换移液器吸头，或使用同一吸头从最低浓度向最高浓度依次接种。同时仅接种有限数量的培养板（1至2块），以避免细胞干燥。
7. 在病毒吸附期间配制微晶纤维素覆盖层（现配现用）。为获得 100 mL 覆盖层，将 10 mL 2.4% 微晶纤维素悬浮液与 10 mL 2× MEM，以及含2% FCS的MEM 80 mL
   1. 调节2的pH值× 用无菌的7.5%碳酸氢钠溶液根据颜色指示将MEM调节至约7.2。加入微晶纤维素悬浮液和MEM，充分混匀。
8. 2小时孵育结束后，向12孔板的每孔中加入2至3 mL覆盖液，无需去除接种物。操作时需小心，避免高病毒滴度的接种物污染相邻孔。将培养板置于 37 °C 和 5% CO₂₂ 孵育6天。孵育期间请勿移动培养板或移动培养箱。
9. 使用结晶紫溶液（8% 结晶紫 [v/v]、2% 甲醛 [v/v] 和 20% 乙醇 [v/v] 溶于水）对细胞进行染色。
   1. 用一张纸保护生物安全柜的工作台面（结晶紫会使表面强烈着色）。
   2. 轻轻摇晃培养板，以去除微晶纤维素覆盖层。吸除上清液，并用缓冲液清洗细胞2次。× 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。逐个处理培养板，以避免细胞干燥。加入1–2 mL结晶紫溶液，静置10–15分钟。移除溶液，该溶液可重复用于后续培养板的染色。
   3. 将培养皿和皿盖浸入新鲜的漂白剂中数秒，然后用自来水彻底冲洗。注意，培养皿和盖子已通过漂白剂去污。
   4. 将培养皿及其盖子放在纸巾上晾干。在用水冲洗后，于室温下干燥，并在室温条件下储存。对于长期储存（数月），应将培养皿避光保存，以保护颜色。需注意，若细胞失去染色，可再次使用结晶紫进行染色。
10. 计算病毒滴度。计数干燥平板孔中肉眼可见的噬斑。检查不同稀释度孔中噬斑数量是否一致（各稀释度间应呈10倍关系）。选择噬斑最易计数的孔。根据接种体积和稀释倍数评估噬斑数量。
    注意： 在所提供的示例中 图1，计数到21个噬斑，稀释倍数为10^-5 稀释。这些对应于滴度

结果

图1：使用空斑试验测定呼吸道合胞病毒（RSV）滴度。 （A）12孔板中空斑滴定试验的结果。显示了接种同一批病毒储存液系列稀释液的六个孔。稀释倍数以10为底的对数表示。接种前三个稀释度的细胞均已脱落。在10^-4、10^-5和10^-6稀释度下观察到的空斑数量一致。（B）空斑计数示意图（黄色数字）。绿色星号指示细胞层上的划痕。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结晶紫溶液	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM（10倍浓缩液），不含谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM，含 GlutaMAX 补充剂	ThermoFisher Scientific	41090-028
碳酸氢钠 7.5% 溶液	ThermoFisher Scientific	25080094
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	ThermoFisher Scientific	15140122