使用放射性标记的逆转录酶检测法评估病毒复制能力

摘要

来源：Claiborne, D. T. 等。一种基于限制性内切酶的克隆方法评估 HIV-1 C 亚型 Gag-MJ4 嵌合病毒的体外复制能力。J. Vis. Exp. (2014)

本视频展示了利用放射性标记的逆转录酶检测方法评估病毒复制能力。含有子代病毒颗粒的培养上清液被加入含有放射性标记核苷酸的逆转录反应体系中。所掺入的信号反映了病毒的产量和复制效率。通过磷屏成像技术检测并比较测试样本与野生型样本之间的信号强度。

方案

1. 细胞培养上清液中逆转录酶（RT）的分析

1. 在生物安全等级3（BSL-3）设施中设置用于放射性材料操作的生物安全柜。
   1. 在安全柜内铺设吸水纸，并将抽吸装置更换为专用于放射性操作的抽吸装置。 
      注意：所有放射性废物必须根据安全规定妥善处理。
2. 向每份1 ml的RT预混液中加入1–2 µl浓度为10 mCi/ml的[α-³³P]脱氧胸苷三磷酸（dTTP）以及4 µl的1 M二硫苏糖醇（DTT）（参见表1）。
3. 使用1,000 µl移液器小心混匀每支含有RT预混液、DTT和[α-³³P] dTTP的1.5 ml微量离心管，然后转移至无菌槽中。
4. 将25 µl标记好的RT混合液加入96孔薄壁聚合酶链式反应（PCR）板的每个孔中。 
   注意：需预留阳性对照（MJ4野生型（WT）感染）和阴性对照（模拟感染）的位置。
5. 向含有RT预混液的PCR板中每孔加入5 µl上清液。
6. 用粘性铝箔封膜密封PCR板，并在热循环仪中37 °C孵育2小时。出于安全考虑，使用Amphyl冲洗移液器吸头，并将吸头弃置于盛有Amphyl废液的小容器中，后续该容器将作为放射性废物处理。
7. 孵育结束后，使用200 µl多通道移液器在铝箔封膜上刺出小孔。 
   注意：若移液器吸头接触到孔内液体，在移至下一列或下一行前必须更换吸头。
8. 将样品混匀5次，每份样品取5 µl转移至DE-81滤纸。室温晾干10分钟。
9. 用1×盐-柠檬酸钠缓冲液（SSC）洗涤印迹5次，每次5分钟，随后用90%乙醇洗涤2次，每次5分钟。晾干。
   1. 将每张印迹分别放入独立的洗涤容器（如三明治储存盒）中，加入足量洗涤缓冲液（1× SSC或90%乙醇（EtOH））以完全覆盖印迹，振荡5分钟。
   2. 将洗涤缓冲液倒入单独容器中并重复洗涤步骤。注意：前3次洗涤液被视为放射性废物，必须妥善处理；后2次洗涤液可按常规方式处理。
10. 待印迹完全干燥后，小心用Saran膜包裹，并在室温下置于密闭暗盒中与磷屏过夜曝光。
11. 使用磷屏成像仪分析磷屏图像，并对放射性转录产物进行定量。
12. 使用OptiQuant软件在每个放射性信号周围画出圆圈。绘制数字光单位（DLU）值以生成复制动力学曲线。
13. 为计算复制能力评分，需对DLU值进行log₁₀转换，并利用第2、4、6天的时间点计算斜率。随后将各组复制斜率除以WT MJ4的斜率，以获得复制能力评分。为降低板内实验变异，必须基于同一RT板中获得的MJ4野生型数值进行归一化处理。

表1：放射性标记逆转录酶检测主混合液配方。
注意：以1 ml分装量在-20 °C保存。

试剂	体积 (ml)
Nuclease-free H2O	419.5
Tris-Cl, pH 7.8 (1 M)	30
Potassium chloride (1 M)	37.5
Magnesium chloride (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0.5 M)	1.02
Polyadenylic acid, potassium salt (2 mg/ml)	1.25
Oligo-dT primer (25 μg/ml)	3.25
总体积	500

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养试剂
Amphyl 清洁剂/消毒剂	Fisher	22-030-394
多通道移液器用储液槽，55 ml	Fisher	13-681-501
1 M 氯化镁溶液	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
逆转录酶定量检测试剂
dTTP，[α-³³P]，3000 Ci/mmol，10 mCi/ml，1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
1 M Tris-Cl，pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	必须用 KOH 调整至 pH 7.8
2 M 氯化钾（KCl）	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	稀释为 1 M 溶液
0.5 M EDTA	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
多聚腺苷酸（Poly rA）钾盐	Midland Reagent Co.	P-3001
寡聚脱氧胸苷酸引物（Oligo d(T) primer）	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	43815-1G
SR，超高分辨率磷屏，小型	Perkin-Elmer	7001485
Corning Costar Thermowell 96 孔板型号（M）聚碳酸酯	Fisher	07-200-245	由 Corning Life 生产
Corning 96 孔微孔板铝封膜，非无菌	Fisher	07-200-684	由 Corning Life 生产
DE-81 阴离子交换滤纸	Whatman	3658-915
二水合柠檬酸三钠	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
氯化钠	Fisher	S671-3
放射自显影暗盒	Fisher	FB-CA-810
Cyclone 储存用磷屏	Packard
PCR 仪，PTC-200	MJ Research