基于荧光素酶的病毒定量样品制备

本文内容

摘要

本视频演示了使用基于荧光素酶的检测方法评估病毒载量的细胞培养样品制备过程。该方法包括用基因改造病毒感染上皮细胞，将病毒上清液和标准品转移至检测孔中，并通过离心和孵育促进病毒感染。荧光素酶的表达作为报告信号，可根据发光信号强度对病毒浓度进行定量分析。

方案

1. 样品制备

获取含有表达荧光素酶的病毒（此处以 VSV∆51-Fluc 为例）的样品，用于滴定并转移至 96 孔板中。或者，可在 96 孔组织培养板中直接进行感染，并直接使用上清液。
保留两列不作处理，用于加入标准曲线。对于直接在 96 孔板中进行的实验，可在实验结束时（感染后 40 小时）进行滴定，或于 -80 °C 保存并在后续时间进行滴定。

2. 病毒滴定用敏感细胞的准备

滴定前24小时，用含10%胎牛血清（FBS）、30 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）制备浓度为2.5 × 10⁵ 个细胞/mL的Vero细胞悬液。
注意：尽管本实验方案使用Vero细胞，但任何适用于水疱性口炎病毒（VSV）感染的敏感细胞系均可使用。
使用微量板分液器，将2.5 × 10⁴ 个细胞（100 μL）接种至96孔白色实底平底板中。
1. 每块板准备12 mL细胞悬液，另加5 mL用于预润。
2. 用50 mL无菌水冲洗管路，清洁微量板分液器的加样盒。
3. 用细胞悬液填充分液器管路，并使5 mL细胞悬液流过系统。
4. 选择可在白色侧壁96孔板每孔中分配100 μL液体的程序。进行分液操作，并根据需要重复用于其他板。若使用不透明白色底板，还需在96孔透明平底板中接种若干孔，用于验证细胞状态和密度。
5. 操作完成后，将残余细胞冲洗回原容器中。通过管路依次注入50 mL 70%乙醇和50 mL温热无菌水，清洗加样盒。
6. 确保每次使用前后均对加样盒和管路进行适当清洁。
将细胞置于37 °C、5% CO₂ 恒湿培养箱中孵育24小时。

3. 病毒标准曲线的制备

在无血清DMEM中制备VSV∆51-Fluc的标准曲线，使其转染至Vero细胞后的最终浓度分别为：10⁸ pfu/ml、10⁷ pfu/ml、10⁶ pfu/ml、10⁵ pfu/ml、10⁴ pfu/ml、10³ pfu/ml、10² pfu/ml和10¹ pfu/ml。每块Vero细胞板每种浓度准备50 μl，另加10%额外量。
注意：为了生成可用于绝对定量的标准曲线，需要通过经典方法测定荧光素酶病毒原液的滴度。否则，可在缺乏精确滴度信息的情况下，通过任意设定基于稀释步骤的病毒滴度实现相对定量。例如，标准曲线的第一步稀释可设为10⁸病毒单位，后续1/10稀释设为10⁷，依此类推。在此情况下，应将数值表示为相对于预设样本的倍数变化，因为绝对定量将不准确。

4. 将样本上清液转移至易感细胞

在光学显微镜下检查接种于透明底96孔板中的Vero细胞，确认单层细胞融合度至少达到95%。
将25 μl样品上清液转移至接种于白色壁板的Vero细胞中。请勿将上清液加入指定用于标准曲线的2个纵列中。
注意：可使用96通道液体处理仪，在单块板的所有孔中同时完成此操作。
使用8通道或12通道多通道移液器，将第3步制备的标准曲线各稀释浓度分别取25 μl加入指定的2个纵列中的Vero细胞孔内。
在室温（RT）下，以430 × g离心5分钟。
在37 °C、含5% CO₂的加湿培养箱中孵育5小时。

材料

本文内容