来源：Chiarella, A. M. et. al., 利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录。J. Vis. Exp. (2018)
本视频展示了利用慢病毒转导技术生成基因修饰小鼠胚胎干细胞的方法。慢病毒颗粒递送抗生素抗性标记，实现外源基因在基因组中的稳定整合，并便于对转导细胞进行筛选。
方法文章
生成慢病毒转导的小鼠胚胎干细胞
19 次观看
⸱
2026年9月30日
本文内容
摘要
方案
1. 慢病毒感染小鼠胚胎干细胞（mESC）
- 培养低代次（低于35代）、无饲养层适应的染色质 体内 在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）基础培养基中培养低代次（低于35代）、无饲养层适应的活体染色质分析（CiA）小鼠胚胎干细胞（mESCs），培养基中添加20% 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1× 非必需氨基酸（NEAA）、青霉素/链霉素（Pen/Strep）、2-巯基乙醇和1:500的白血病抑制因子（LIF），置于含5% CO2的37 °C培养箱中培养 37 °C 含5% CO₂的培养箱2.
注意： LIF 来源于可产生 Lif-1C-alpha 的 Cos 细胞（COS LIF）的上清液，这些细胞以批次收集后于 -80 °C 冻存。80 °C.- 将细胞培养于已用含0.1%明胶的1×磷酸盐缓冲液（PBS）预孵育1–3小时并随后用1×PBS洗涤的培养板中。每日换液，根据细胞密度每2–3天传代一次。
注意： 形态上，胚胎干细胞（ES）克隆应较小、呈圆形，且彼此分离。
- 将细胞培养于已用含0.1%明胶的1×磷酸盐缓冲液（PBS）预孵育1–3小时并随后用1×PBS洗涤的培养板中。每日换液，根据细胞密度每2–3天传代一次。
- 感染前1天将mESC传代至12孔板（每孔100,000个细胞）。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。对于在10 cm培养皿中培养的细胞，吸除旧培养基，加入5 mL 1×PBS，吸除PBS，再加入1 mL 0.25%胰蛋白酶。将细胞在37 °C下用胰蛋白酶孵育8分钟， 37 °C孵育过程中间阶段轻轻摇晃并轻敲培养皿。此步骤的目的是使细胞充分解离为单细胞悬液。
- 在从15 cm培养皿中更换293T人胚肾（HEK）细胞的培养基后48小时，移除上清液并转移至50 mL离心管中。
- 以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞碎片。
- 通过 0.45-µm 滤膜过滤上清液。µm 膜
注意： 务必使用无表面活性剂的醋酸纤维素（SFCA）膜，因为某些其他材料可能会吸附病毒，从而显著降低产量。 - 使用配备SW32转子的离心机进行超速离心浓缩病毒，在4 °C下以20,000 rpm（约72,000 × g）离心2.5 h 4 °C.
- 在病毒进行超速离心浓缩的同时，用含有新鲜ES培养基处理12孔板中的CiA mESC，培养基中包含 5 µg/mL 聚凝胺
- 病毒浓缩完成后，小心吸除上清液，并将病毒沉淀重悬于 100 µL 1× PBS（避免产生过多气泡）。
- 将病毒和1×PBS加入1.5 mL微量离心管中。在300 × g（或最低转速）下涡旋/振荡管子，以充分重悬病毒。在小型台式离心机中离心5–10秒，以去除气泡。
- 加入 30 µL 将病毒加入12孔板的每孔中。轻轻摇晃培养板，随后在1,000 × g离心20分钟。
注意： 添加的病毒量可根据病毒滴度进行调整，而病毒滴度与递送载体的大小成反比。- 或者，用液氮快速冷冻病毒，并在 -80 °C然而，冷冻病毒会降低病毒滴度。
- 将12孔板放回 37 °C 将培养板放回37 °C培养箱，次日早晨（约16小时后）更换新鲜的ES培养基。
- 感染48小时后，通过添加适当的抗生素（例如， 1.5 µg/mL 嘌呤霉素 10 µg/mL 的杀稻瘟菌素等）。每天更换培养基，若大部分细胞漂浮或死亡，则用1×PBS洗涤细胞。在37 °C、5% CO₂培养箱中，将筛选培养基作用于细胞72–96小时。 37 °C 含5% CO₂的培养箱2.
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES（用于组织培养） | Corning | 25-060-Cl | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | 每批次均经质量检测 |
| 病毒离心管 | Beckman Coulter | 344058 | |
| 病毒滤膜 | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-056 | 含EDTA |
| 0.05 % 胰蛋白酶 | Gibco | 25400-054 | 含EDTA |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr | |
| 超速离心机 | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 离心转子 | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti 离心吊篮 | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 人胚胎肾细胞 | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| CiA:Oct4 小鼠胚胎干细胞（mESC） | 由 G. Crabtree 惠赠 | ||
| 表达 Lif-1C-alpha 的 Cos 细胞 | 由 J. Wysocka 惠赠 |
