利用代谢与荧光筛选鉴定重组痘苗病毒感染细胞

摘要

来源：Marzook, N. B., 等，高效生成荧光标记的痘苗病毒蛋白的方法。J. Vis. Exp. (2014)

本视频展示了利用质粒介导的同源重组在感染的上皮细胞中生成重组痘苗病毒的方法。荧光和代谢标记物可用于筛选和鉴定表达带标签蛋白的病毒。

方案

重组病毒的制备

1. 如图1所示，在无血清培养基中以感染复数（MOI）> 1的条件，用痘苗病毒感染一层BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1（源自CV-1细胞的猴肾上皮细胞系）] 细胞。
2. 感染后1小时，用DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）恢复细胞，并在无血清培养基中转染重组载体质粒与转染试剂按3:1比例组成的混合物。
3. 24小时后，用不含胎牛血清（FBS）的DMEM刮取并回收细胞，进行三次冻融循环以裂解细胞并释放病毒颗粒。
4. 使用含10% FBS的DMEM液体覆盖层及GPT（来自E. coli的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）筛选试剂（霉酚酸（25 µg/ml）和黄嘌呤（250 µg/ml））进行空斑试验，步骤如下：
   1. 在6孔板中接种单层BS-C-1细胞。
   2. 用含有病毒颗粒的冻融细胞进行系列稀释，感染100%汇合的单层细胞，以确保各个空斑之间充分分离。
   3. 加入含10% FBS并含有GPT筛选试剂（霉酚酸和黄嘌呤，终浓度分别为25 µg/ml和250 µg/ml）的液体DMEM覆盖层。
5. 24小时培养后，移除液体覆盖层，使用荧光显微镜观察呈现弥散性红色荧光的空斑，该荧光表明TDS（瞬时显性筛选）载体中的mCherry已整合入病毒基因组。根据目标基因和所选荧光标签的不同，也可能在同一红色空斑中观察到标记基因的局部荧光。
6. 针对每种重组病毒，使用移液器吸头及100 µl含5% FBS的DMEM对多个空斑进行局部刮取，将细胞转移至Eppendorf管中，随后对刮取的细胞进行三轮冻融以释放重组病毒。
7. 将含有冻融后病毒的DMEM加入12孔板中的单层细胞，利用生长培养基中的GPT筛选试剂扩增重组病毒。感染后24小时刮取成功扩增的细胞。
8. 对表现出红色荧光的成功扩增空斑再次进行空斑试验，此次采用琼脂糖覆盖层并加入GPT筛选，具体如下：
   1. 在6孔板中接种单层BS-C-1细胞。
   2. 对重组病毒进行系列稀释，并用无FBS的DMEM以逐步增加的稀释度感染各孔。
   3. 感染后1小时，移除液体培养基，每孔加入含2.5% FBS、292 µg/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素以及GPT筛选试剂的最小必需培养基（MEM）中配制的0.5%琼脂糖覆盖层。
9. 感染后2–3天，挑选同时显示红色荧光和所选荧光标签颜色的空斑进行再次扩增，此次不再添加GPT筛选试剂。
10. 下一次空斑试验使用不含筛选试剂的琼脂糖覆盖层。
11. 挑选已失去弥散性红色荧光但保留与所选标签对应的局部荧光的空斑。
12. 继续在无筛选条件下进行空斑纯化，直至获得纯化的重组病毒储备液，这些病毒已丢失mCherry和gpt筛选基因，但仍保留与所选标签对应的局部荧光。通过空斑试验验证储备液的纯度；所有空斑应具有相似的空斑表型。

结果

图1. 构建重组痘苗病毒的实验流程示意图。 遗传和细胞水平上发生的事件被展示出来，并附有代表性噬斑图像，概述了构建A3-GFP标记的荧光痘苗病毒后的各个步骤。A接种痘苗病毒的细胞转染TDS重组载体。B在此图中，仅展示了左侧同源重组的结果，示例中选用的荧光标签为GFP。右侧同源重组将以类似方式导致整个TDS质粒被整合到基因组中，区别在于在中间步骤中，标签将与整个目标基因发生融合。 即， 步骤C：在细胞单层上用重组混合物进行噬斑分析，并施加GPT筛选。C同时表现出红色和绿色荧光（分别对应 mCherry 和 GFP 表达）的噬斑被挑选并扩增。一旦去除筛选压力，将失去对应于mCherry和gpt筛选基因丢失的红色荧光 gpt 和 mCherry 基因（D），挑选仅表现出绿色荧光的噬斑并进行扩增（E).

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
霉酚酸	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	溶于 0.1 N NaOH
黄嘌呤	Sigma-Aldrich	X0626-5G	溶于 0.1 N NaOH
FuGENE HD 转染试剂	Promega	E2311
配备 Chroma 滤光片 31001、31002 的荧光显微镜	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)