来源：Fuchs, M. et al. 腺病毒感染转染法：通过耗竭-拯救实验研究分子伴侣在细胞形态动力学中的作用。J. Vis. Exp. (2016)
本视频展示了在宫颈癌细胞中，通过腺病毒介导的荧光转基因递送与siRNA-磷酸钙转染相结合的方法。腺病毒表达一种荧光替代蛋白，而siRNA通过与RISC结合诱导靶向mRNA降解。这种顺序共转染方法可同时实现内源蛋白的敲低和转基因介导的功能性挽救，从而通过荧光成像实现对蛋白替换的可视化与验证。
方法文章
癌症细胞中腺病毒转导与siRNA介导的基因沉默联合应用
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2026年9月30日
本文内容
摘要
方案
- 利用磷酸钙（CaPi）沉淀法在 HeLa-RFP-H2B 细胞中进行腺病毒转导及通过小干扰 RNA（siRNA）转染实现内源蛋白敲低
注意：在所有腺病毒感染实验中，使用携带无关基因（例如，LacZ）或无基因的对照腺病毒，以达到最低感染复数（MOI）（10-20 个噬斑形成单位（PFU）/细胞），同时使用最少量的携带目的基因的重组腺病毒。
注意：该操作步骤已被证明有助于在大量细胞群体中实现每细胞表达量的标准化。
- 细胞接种后一天，从额外接种的培养皿中计数细胞数量。吸除培养基，用 1 mL 0.05% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）冲洗一次。再次加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育至所有细胞脱落。使用 1 mL 移液器充分吹打使细胞分散，用血细胞计数板计数每毫升细胞数量。
- 确定转导所需病毒量，使每个细胞的感染复数（MOI）为 2 PFU 的目的蛋白（POI）和 18 PFU 的空载体（例如 LacZ），总计每个细胞 20 PFU。同时，每个编码绿色荧光蛋白（GFP）标记的肌动蛋白和红色荧光蛋白（RFP）标记的 α-微管蛋白的杆状病毒各转导 4 PFU。使用以下腺病毒感染（adenofection）方案进行细胞转导。
- 在无菌操作台中为每种实验条件准备一个 1.5 mL 塑料离心管，并加入 400 μL 预热的 α 最低必需培养基（αMEM）。
- 将病毒分装样品在冰上缓慢解冻，如有必要，用适当溶液稀释病毒原液，以确保移液体积大于 1 μL，从而减少移液误差。
- 将按条件计算好的病毒量加入各含 400 μL αMEM 的 1.5 mL 塑料离心管中，通过移液轻轻混匀。立即将病毒原液放回 -80 °C 保存，以维持其活性。
- 吸除细胞培养基，轻轻将病毒混合液逐滴加入细胞中。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，并在无菌操作台中每 15 分钟轻轻摇动培养板一次，持续 1 小时，确保病毒均匀覆盖细胞。使用少量培养基有助于病毒与细胞充分接触。
- 孵育结束后，向每孔轻轻加入 1.6 mL αMEM，使总体积达到 2 mL，通过加入 2 mM 胸腺嘧啶核苷启动细胞同步化，并继续在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。
- 同时，按照 CaPi 转染法配制 siRNA 转染混合液（见图 1）。如无需 siRNA，可用无菌水替代 siRNA 体积，进行空载转染。
- 每种实验条件配制 200 μL 混合液，每个重复共需 400 μL。以下示例基于最终 siRNA 浓度为 50 nM，需根据每种目的蛋白进行调整。在 1.5 mL 塑料离心管中，加入 50 μL 1 M CaCl2 和 11 μL 20 μM siRNA 至 139 μL 无菌 H2O 中，涡旋混匀。短暂离心后，逐滴缓慢加入 200 μL 2× HEPES 缓冲盐水（HBS2x）（280 mM NaCl，50 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），1.5 mM Na₂HPO₄，pH 7.01–7.05）。
注意： 滴加液滴越小，形成的沉淀颗粒越小，转染效率越高。使用 200 μL 移液器通过空气吹打轻轻混匀三次。 - 室温（RT）孵育 30 分钟。将 200 μL 转染混合液缓慢加入每孔中，并进行交叉摇动。将培养板转移至 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16 小时。
- 次日，用 2 mL 预热的 HEPES 缓冲液（6.7 mM KCl，150 mM NaCl，10 mM HEPES，pH 7.3）冲洗细胞两次，然后加入 2 mL αMEM。每次操作不超过四个细胞培养板，因为温度变化会影响细胞周期长度。
- 在倒置荧光显微镜下以 20–40 倍（空气物镜）放大倍数观察感染效率，并为每种实验条件在荧光和透射光通道下各采集三张代表性图像用于记录。7 小时后，加入 2 mM 胸腺嘧啶核苷，并继续在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16 小时。
- 次日，即 siRNA 转染和病毒感染后 48 小时，用 2 mL 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞两次，随后在不含酚红的 2 mL αMEM 中释放 7 小时，用于活细胞成像；或在含酚红的 αMEM 中用于蛋白提取。
- 转染后 48 小时收集各实验条件的细胞，制备蛋白提取物并进行 Western 印迹分析，以评估基因敲低效率及内源性蛋白的表达水平。
注意： 使用针对目的蛋白的抗体以及适当的上样对照抗体。通过梯度加载对照细胞裂解液（转染对照 siRNA）的蛋白量（如 1、½、¼、⅛）建立滴定曲线，以准确评估敲低效率。
结果
图1. 典型腺转染实验方案的设计。 本图展示了使用CaPi沉淀法（灰色下划线标注）或阳离子脂质转染试剂法（黄色高亮标注）的典型实验的连续步骤，包括细胞接种、腺病毒与杆状病毒感染、siRNA双链转染，以及通过双胸苷阻断实现的细胞同步化。两种方案的时间线（以小时为单位）显示在图的右侧。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| 纤连蛋白 | Sigma | F1141 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | 加拿大魁北克 Dr Sabine Elowe 惠赠 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher | 25030081 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| 最低必需培养基（MEM）α | Wisent | 310-101-CL | |
| 不含脱氧核糖核苷/核糖核苷的最低必需培养基（MEM）α | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| 不含酚红的最低必需培养基（MEM）α | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na₂HPO₄ | Biobasic | S0404 | |
| 腺病毒定制设计 | Welgen | Custom design | |
| 氯化钙 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| siRNA 双链体 | Dharmacon | Custom design | |
| 胸苷 | Sigma | T9250 | |
| 2.5% 胰蛋白酶 | Thermo Fisher | 15090-046 |
