工程化病毒样颗粒表面可及半胱氨酸残基的标记

摘要

来源：Natilla, A., 和 Hammond, R. W. 在烟草本塞姆氏植物中产生的玉米粗缩病毒样颗粒上半胱氨酸残基的溶剂可及性分析及多肽与病毒样颗粒的交联。J. Vis. Exp. (2013)

本视频展示了利用巯基反应性染料对中国本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中产生的突变型病毒样颗粒（VLPs）进行位点特异性荧光标记，随后通过纯化和凝胶电泳验证其表面修饰的方法。

方案

1. 从Nicotiana benthamiana植物中进行病毒接种及病毒样颗粒纯化

1. 使用Ambion的T7-mMessage mMachine试剂盒，从携带玉米粗缩病毒（MRFV）野生型（wt）和半胱氨酸突变外壳蛋白（CP）基因的马铃薯X病毒（PVX）载体质粒中制备加帽的T7-RNA转录本。
2. 对于每个T7转录反应，用10 μL反应液接种两片完全展开的N. benthamiana叶片，并将植株置于温室中培养10天，条件为60%湿度，光照16小时（25,000–30,000 lux）温度25 °C，黑暗8小时温度20 °C。
3. 接种后10天（dpi）收获N. benthamiana病毒感染的叶片，称取植物组织（50克）并置于冰上。
4. 在含有100 mL预冷的0.5 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）的条件下，使用搅拌器匀浆植物材料（每克植物组织使用2 mL缓冲液）。
5. 将匀浆液通过三层纱布过滤，并在4 °C下以27,000 × g离心30分钟进行澄清。将上清液转移至预冷的量筒中，测量体积后转入预冷的无菌烧杯中。弃去沉淀。
6. 向上清液中加入10%聚乙二醇8,000（PEG 8,000），在4 °C下搅拌15分钟，并在4 °C下继续孵育45分钟，以沉淀病毒样颗粒（VLPs）-PEG复合物。
7. 在4 °C下以27,000 × g离心20分钟，去除上清液。
8. 向沉淀中加入8 mL含2% Triton X-100的0.05 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5），充分涡旋离心管以释放沉淀。将沉淀和缓冲液转移至预冷的无菌烧杯中。立即用2 mL相同缓冲液冲洗离心管，并将洗涤液加入烧杯中。在4 °C下搅拌悬浮液直至沉淀完全溶解（通常约1小时）。
9. 在4 °C下以27,000 × g离心5分钟进行澄清，弃去沉淀，将上清液在4 °C下以140,000 × g离心2小时。
10. 将沉淀重悬于1 mL 0.05 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）中，并将悬浮液铺加到用0.05 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）配制的10–40%蔗糖梯度上。
11. 在4 °C下以140,000 × g离心3小时。
12. 用光线照射离心管顶部，收集距管顶4 cm处的光散射上层条带，用0.05 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）稀释后，在4 °C下以140,000 × g再次离心3小时。
13. 将沉淀重悬于0.5 mL无菌水中，于4 °C保存，最长可保存六个月。
14. 通过Bradford蛋白测定法定量VLPs浓度。VLPs的产量为每克植物组织1至3 μg。

2. VLPs的荧光素-5-马来酰亚胺标记反应

1. 在50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）中配制1 mM荧光素-5-马来酰亚胺（427.37 g/mol）溶液。使用涡旋振荡器混匀，并确认完全溶解。用铝箔包裹管壁以避光。
2. 将荧光素-5-马来酰亚胺加入第1步制备的病毒样颗粒（VLPs）中并混匀。荧光素-5-马来酰亚胺的摩尔量应为巯基摩尔量的25倍。通常，使用30 μL浓度为1 μg/μL的VLPs和60 μL荧光素-5-马来酰亚胺溶液可获得理想结果。 30 μL VLPs在浓度为 1 μg/μL 和 60 μL 使用60 μL荧光素-5-马来酰亚胺溶液可获得理想结果。
3. 在室温下孵育反应2小时，或在4 °C过夜孵育 4 °C.
4. 通过加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为50 mM来终止反应。
5. 使用脱盐离心柱（Thermo Scientific Inc., Rockford IL）并通过在1,500 × g下离心2分钟去除未反应的荧光素 × 在室温下以 g 离心。
6. 对于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，加入 10 μL 2 × SDS-PAGE Laemmli 样品缓冲液至 10 μL 每种反应的产物。将标记的蛋白质置于避光条件下，4 °C 保存不超过一个月，或分装为单次使用 aliquots 后于 -20 °C 保存不超过 3 个月。 4 °C 最长可保存一个月，或分装为单次使用 aliquots 后于 -20 °C 保存最长三个月20 °C 长达3个月。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超薄壁透明离心管	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒	Life Tecnologies	AM1344M
荧光素-5-马来酰亚胺	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 已停用，替换为 F150
Laemmli 缓冲液	Bio-Rad	1610737
Tris-甘氨酸 SDS（十二烷基硫酸钠）电泳缓冲液	Invitrogen	LC2675
Tris-甘氨酸转移缓冲液	Invitrogen	LC3675
硝酸纤维素膜滤纸夹心组件	Invitrogen	LC2001
EZ-Link 马来酰亚胺-聚乙二醇（PEG）2-生物素，免称量形式	Thermo Scientific	21901