通过二硫键再桥接实现病毒样颗粒的荧光功能化

摘要

来源：Chen, Z., et al. 利用二溴马来酰亚胺-二硫键化学法构建偶联诱导型荧光聚乙二醇化病毒样颗粒。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了通过聚乙二醇（PEG）连接臂对还原的二硫键进行再桥接，实现病毒样颗粒的荧光功能化，从而制备出稳定且可追踪的偶联物，适用于生物医学领域中的细胞成像和靶向递送。

方案

1. 在噬菌体 Qβ 上偶联二溴马来酰亚胺（DB）化合物

1. 还原Qβ上的二硫键。
   1. 将0.0020 g三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶于1 mL超纯水中，配制成100倍浓缩储备液。
      注意：还原前需新鲜配制TCEP。
   2. 向微量离心管中加入200 µL Qβ（5 mg/mL）。
   3. 随后加入20 µL 100倍浓缩的TCEP储备液。
   4. 室温孵育1小时。
2. 使用二溴马来酰亚胺聚乙二醇（DB-PEG）重新桥接还原后的二硫键。
   1. 将0.0017 g二溴马来酰亚胺-聚乙二醇（DB-PEG）溶于100 µL DMF中。
   2. 加入680 µL 10 mM磷酸钠溶液（pH 5）。
   3. 将还原后的Qβ加入DB-PEG溶液中，并在365 nm紫外灯（UV）下观察混合过程。混合后可立即用365 nm手持式紫外灯观察到明亮的黄色荧光。
   4. 将反应液置于旋转器上，室温（RT）反应过夜。
3. 使用离心过滤器（分子量截留值（MWCO）= 10 kDa），以1×PBS（磷酸盐缓冲盐水）在4 °C、3,283 × g条件下离心20分钟，重复三次，纯化反应混合物。
4. 通过非还原性SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和天然琼脂糖凝胶电泳监测偶联反应。
   注意：VLPs（病毒样颗粒）在天然琼脂糖凝胶中以完整颗粒形式迁移，其分离基于电荷、大小和形状。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3-二溴马来酰亚胺 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
聚乙二醇	Alfa Aesar	41561-22
磷酸钠	Fisher Scientific	AC424375000
丙烯酰胺/双丙烯酰胺	P212121	RP-A11310-500.0
十二烷基硫酸钠	Sigma Aldrich	L3771-100G
过硫酸铵	Fisher Scientific	BP179-100
Amicon Ultra-4 离心过滤装置	Millipore Sigma	UFC801024
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-53A
微量离心管：1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 轨道摇床	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 移液器	Gilson	F123602
P200 移液器	Gilson	F123601
P100 移液器	Gilson	F123615
P20 移液器	Gilson	F123600
P10 移液器	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 实验室经典高精度天平	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100