安全的病毒样本制备用于透射电子显微镜观察

摘要

来源：Blancett, C. D.，等．生物安全条件下利用胶囊对病毒样本进行负染色的方法．J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了用于透射电子显微镜的安全病毒样本制备方法。病毒颗粒先用戊二醛固定，再用电子致密染色剂染色，随后通过四氧化锇蒸气固定以稳定结构并确保完全灭活，从而在提高高质量透射电镜成像对比度的同时，保障病毒样本操作的安全性。

方案

1. 使用水性戊二醛和1%四氧化锇蒸气灭活在生物安全 containment 环境中进行负染的胶囊法

1. 在生物安全防护的生物安全柜（BSC）内，将40 µL病毒悬液吸入连接在移液器上的胶囊中。
   注意：移液器在整个操作过程完成前应始终保持与胶囊连接。
2. 将移液器侧放10分钟，使载网保持水平方向。此举有助于病毒颗粒均匀分布于包被的载网上。
3. 在生物安全柜内的胶囊中对病毒进行灭活。
   1. 拿起移液器，按下推杆，将病毒溶液排入废液容器中。
   2. 向胶囊中吸入40 µL的2%戊二醛固定液。注意：戊二醛为有害化学品，操作时需采取适当防护措施。戊二醛可在普通生物安全柜中短时间使用，但若需长时间敞口操作，则必须在带管道的生物安全柜或化学通风橱中进行。
   3. 将移液器侧放20分钟，以确保样品充分固定。
   4. 排出固定液，并向胶囊中吸入40 µL去离子水（DI水）以清洗残留固定液。重复此清洗步骤，共进行3次漂洗。
4. 向胶囊中吸入40 µL的1%醋酸铀酰（UA）或1%磷钨酸钾（PTA）溶液，静置30秒。
   注意：染色时间可根据病毒样品的不同在10秒至1分钟之间调整。
   注意：UA为α射线发射体，且具有累积毒性，操作时需采取适当防护措施。
5. 将胶囊从移液器上取下，当载网仍处于胶囊内时，用滤纸接触载网边缘，吸干载网。
6. 四氧化锇蒸气灭活程序。
   1. 将打开盖子的胶囊放入含有浸透1%四氧化锇溶液滤纸的50 mL离心管中。注意：四氧化锇具有极高毒性且蒸气压低，必须在带管道的生物安全柜或化学通风橱中操作，操作时需采取适当防护措施，并在工作区域张贴警示信息。
   2. 将50 mL离心管密封1小时，使四氧化锇蒸气充分渗透。随后对离心管进行去污处理，并将其从生物安全防护区域转移至BSL-2电镜（EM，电子显微镜）设施。
7. 从胶囊中取出电镜载网。
   1. 在BSL-2电镜设施中，将胶囊从离心管中取出，并安装到移液器上。
   2. 向胶囊中吸入40 µL去离子水，并将水排入废液容器中，重复三次。
   3. 将胶囊从移液器上取下，用滤纸接触载网边缘，吸干载网。
   4. 待载网自然干燥后，妥善保存，用于后续透射电子显微镜（TEM）成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Formvar/碳膜包被的透射电镜载网	SPI	3420C-MB	200目铜网 Pk/100
mPrep/g胶囊	EMS	85010-01	盒装
mPrep/f连接器	EMS	85010-11	标准型 16个/包
戊二醛	EMS	16320	50%溶液，电镜级
四氧化锇	EMS	19190	4%水溶液
醋酸铀酰	EMS	22400	粉末
磷钨酸钾	EMS	19500	粉末
滤纸	Whatman	1450-090	50号规格
透射电子显微镜	JEOL	JEM-1011	TEM