体外重组与纯化病毒核衣壳样颗粒

摘要

来源：Gao, Y., et al. 呼吸道合胞病毒特异性核衣壳的生成与组装。J. Vis. Exp. (2021)

该视频展示了由纯化的无RNA核蛋白-磷蛋白复合物在体外组装病毒特异性核衣壳的过程，通过尺寸排阻色谱法纯化组装产物，并验证组装颗粒中存在全长病毒RNA。

方案

1. 分子克隆

注意：采用连接酶无关克隆（Ligase Independent Cloning, LIC）方法构建呼吸道合胞病毒（RSV）双顺反子共表达质粒。LIC 是 20 世纪 90 年代初开发的一种技术，利用 T4 DNA 聚合酶的 3’-5’ 外切酶活性，在载体和 DNA 插入片段之间产生具有互补性的黏性末端。构建所用的载体为 2BT-10 载体 DNA，其在开放阅读框（ORF）的 N 末端包含一个 10x His 标签（图 1）。

1. 使用 SSPI 消化对 LIC 载体进行线性化。
   1. 混合 10 μL SSPI 10X 缓冲液 4 μL SSPI酶，浓度为5 U/μL，等体积的 5 μg 质粒小提DNA，以及无菌ddH₂O₂O至 100 μL.
   2. 37 °C 下孵育消化液 3 小时 37 °C.
   3. 在1.0%琼脂糖凝胶上进行酶切产物电泳，以提取载体DNA。
   4. 使用凝胶回收试剂盒进行提取和纯化。将最终体积的载体DNA溶于 30 μL ddH₂O₂O，并在 -20 °C.

2. 使用 N1-391 正向引物、N1-391 反向引物、P1-126 正向引物和 P1-126 反向引物制备 N1-391 和 P1-126 的 DNA 插入片段（表1).

   注意： 线性化载体之间存在足够的重叠，以确保熔解温度在 55 °C 和 60 °C对于反向引物，由于相同原因，其与线性化载体的反向互补链之间也存在足够的重叠区域。

   表1. 引物序列。

   引物	序列
   N1-391 正向引物	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3’
   N1-391 反向	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3'
   P1-126 正向	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3'
   P1-126 反向	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3’

   1. 使用指定条件对DNA插入片段进行聚合酶链式反应（PCR）扩增 表 2 和 表3.
   2. 提取扩增的DNA片段。将上一步的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，然后通过凝胶回收法提取并纯化目标条带。将提取的DNA最终溶于 15 μL ddH₂O₂O.

   表2. DNA插入片段扩增的PCR试剂

   DNA插入片段的PCR扩增
   15 μL	10x Pfu DNA聚合酶反应缓冲液
   3 μL	正向引物（100 μM 浓度
   3 μL	反向引物（100 μM 浓度
   15 μL	2.5 mM 浓度的脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合液
   6 μL	质粒DNA包含N或P基因（100 ng/μL） μL)
   7 μL	二甲基亚砜（DMSO）
   3 μL	Pfu 聚合酶，2.5 U/μL
   定容体积 150 μL	无菌 ddH₂O2O

   表3. DNA插入片段PCR扩增的热循环程序

   DNA 插入片段的 PCR 扩增
   步骤	时间	温度	循环次数
   变性	4 分钟	95 ºC	1
   变性	45 秒	95 ºC	30
   退火	30 秒	62 ºC
   延伸*	90 秒	72 ºC
   延伸	10 min.	72 ºC	1
   暂停	∞	4 ºC	1
   上述 150 μL 混合物可进行三个独立的PCR反应（3 × 50μL).
   *对于Pfu DNA聚合酶，延伸阶段的推荐速度为1 kb/min。由于N1-391基因和P1-126基因的长度均短于1.5 kb，因此延伸步骤使用90秒。

3. T4 DNA聚合酶处理载体和插入片段DNA（表4).

   表4. T4 DNA聚合酶处理

   T4 DNA 聚合酶处理
   10 x 缓冲液	2 μL
   载体/插入片段DNA（0.1 pmol 载体或 0.2 pmol 插入片段）	5 μL
   25 mM dNTP*	2 μL
   100 mM DTT	1 μL
   T4 DNA 聚合酶（LIC 认证）	0.4 μL (1.25 U)
   无菌 ddH₂O2O	9.6 μL
   *dGTP 用于载体，dCTP 用于插入DNA。

   注意： 必须分别对载体DNA和插入DNA进行处理。

   1. 将混合物在室温下孵育40分钟。然后，在 75 °C 20分钟。将反应混合物置于-20 °C.
4. 退火LIC载体和插入载体。
   1. 设置一个阴性对照 2 μL LIC 载体 DNA 的 2 μL 无菌ddH₂O₂O.
   2. 混合 2 μL 插入DNA片段 2 μL 上一轮T4 DNA聚合酶反应中获得的LIC载体DNA置于0.2 mL离心管中。
   3. 在室温下进行退火反应，持续10分钟。
   4. 用淬灭反应 1.3 μL 浓度为 25 mM 的乙二胺四乙酸（EDTA）。
   5. 将反应体系转入 100 μL 的 大肠杆菌 Top10 感受态细胞并涂布于氨苄青霉素筛选平板上。
5. 鉴定阳性构建体。
   1. 制备质粒小提溶液。可通过挑取单菌落并接种于Luria Broth（LB）培养基中进行。通常选取3个菌落即可。
   2. 在4°C下孵育混合物过夜 37 °C.
   3. 在 4,560 × g 条件下离心混合物 10 分钟，弃去上清液。
   4. 将沉淀重悬于 250 μL 加入P1缓冲液，并使用离心柱式质粒小提试剂盒制备质粒小量提取物。
   5. 使用 AseI 或其他限制性内切酶对质粒小提产物进行消化分析。
   6. 将样品上样至0.8%琼脂糖凝胶，电泳跑胶以分析酶切质粒。在紫外灯下观察凝胶结果。
   7. 使用测序服务验证阳性产物的序列。

6. 获取共表达DNA插入片段。

   1. 使用先前构建的 2BT-10 N1-391 和 2BT-10 P1-126 作为模板，通过 PCR 扩增获得 N1-391 和 P1-126。
   2. 使用以下PCR条件，对2BT-10 N1-391质粒进行第一次PCR扩增以获得N1-391： 表2 和 表3 使用 N1-391 正向引物和反向引物 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
   3. 使用正向引物 5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3’ 对 2BT-10 P1-126 质粒进行第二次 PCR 扩增，以获得 P1-126 片段 ́以及P1-126反向引物（使用上述PCR条件） 表2 和 表3).
   4. 最后，对前两次PCR反应的混合产物进行重叠PCR，以连接N1-391和P1-126。使用N1-391上游引物和P1-126下游引物。PCR反应条件如下： 表5 和 表6.

   表5. 重叠PCR试剂

   重叠PCR
   15 μL	10 X Pfu 聚合酶反应缓冲液
   3 μL	正向引物（100 μM)
   3 μL	反向引物（100 μM)
   15 μL	dNTP混合物（2.5 mM）
   3 μL	第一轮PCR获得的DNA，其中包含N1-391基因（100 ng/μL）μL )
   3 μL	第一轮PCR获得的DNA，其中包含P1-126基因（100 ng/μL）μL )
   7 μL	DMSO
   3 μL	Pfu 聚合酶（2.5 U/μL)
   加液至指定体积 150 μL	无菌 ddH₂O2O

   表6. 重叠PCR热循环程序。

   重叠PCR
   步骤	时间	温度	循环
   变性	4 分钟	95 °C	1
   变性	45 秒	95 °C	30
   退火	30 秒	62 °C
   延伸*	2 分钟	72 °C
   延伸	10 min.	72 °C	1
   暂停	∞	4 °C	1
   上述 150 μL 混合物可进行三次独立的PCR反应（3 x 50 μL).
   *对于Pfu DNA聚合酶，延伸阶段的推荐速度为1 kb/min。此处，基因N1-391和P1-126的总长度短于2.0 kb，因此延伸步骤使用2分钟。

7. 将载体与DNA插入片段连接。
   1. 按照步骤1.3中的方案，用T4 DNA聚合酶处理重叠PCR产物。
   2. 按照第1.4步中的方案，对LIC载体和PCR产物进行退火处理。
   3. 按照步骤1.5中的方案鉴定阳性构建体。

2. 蛋白质表达与纯化

注意：使用 E. coli 构建共表达 N 和 P 蛋白的双顺反子载体。在 37 °C 下培养细胞，但在 16 °C 的较低温度下过夜诱导表达。通过钴柱、离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法纯化蛋白复合物（图 2）。

1. 使用 E. coli BL21(DE3) 菌株进行蛋白表达。在 LB（Luria 肉汤）培养基中于 37 °C 下培养 4 L 细胞培养物，直至 OD₆₀₀ 达到 0.6。
2. 将温度降至 16 °C，1 小时后加入 0.5 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，过夜培养。
3. 在 4,104 × g 条件下离心细胞 25 分钟，弃去上清液。
4. 用 200 mL 裂解缓冲液 A（50 mM 磷酸钠，pH 7.4，500 mM NaCl，5 mM 咪唑，10% 甘油，0.2% NP40）重悬细胞沉淀。每 1 L 细胞培养物使用 50 mL 裂解缓冲液重悬细胞沉淀。

5. 采用超声处理裂解细胞，总时长 15 分钟，工作 3 秒，间歇 3 秒。随后在 37,888 × g 条件下离心 40 分钟。

   注意：可在超声处理前将细胞于 -80 °C 冰箱中冷冻，以暂停实验流程。

6. 将上清液上样至钴离子亲和重力层析柱（柱直径 × 柱长：2.5 cm × 10 cm），柱内填料约为 10 mL，预先用 5–10 柱体积（CV）的裂解缓冲液平衡。
7. 用 5 CV 缓冲液 B（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1 M NaCl，10% 甘油，5 mM 咪唑）和 5 CV 缓冲液 C（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，500 mM NaCl，10% 甘油，5 mM 咪唑）洗涤层析柱。
8. 使用 2 CV 缓冲液 D（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，500 mM NaCl，250 mM 咪唑）从填料中洗脱蛋白。
9. 用 QA 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，5% 甘油）将洗脱的蛋白稀释 5 倍，用于 Q 柱纯化。
10. 用 QA 缓冲液洗涤 5 mL Q 柱以平衡层析柱，然后使用蠕动泵（例如 Rabbit）将稀释后的样品上样至 Q 柱。
11. 将 Q 柱连同 QA 缓冲液和 QB 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1.5 M NaCl，5% 甘油）安装至高效液相色谱仪（HPLC），设置流速为 1 mL/min。
12. 运行“泵清洗”程序，先用 QB 缓冲液清洗系统，再用 QA 缓冲液清洗（每种缓冲液 1–2 柱体积），然后将系统流速设为 3 mL/min。
13. 设置 UV1 为 280 nm，UV2 为 260 nm。使用 96 孔深孔板收集各组分。
14. 采用逐步梯度洗脱方式，使用洗脱剂（QB 缓冲液），每次增加 5% 的 QB 缓冲液比例，每个浓度梯度使用 3–4 柱体积，起始为 0% QB。N0P 蛋白复合物在 15% QB 缓冲液条件下洗脱。
15. 待所有蛋白洗脱完毕后，用 100% QB 缓冲液（2 柱体积）清洗层析柱。
16. 使用凝胶过滤 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱（柱直径 × 柱长：1.0 cm × 30 cm）对蛋白进行分离，并用缓冲液 E（20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.4，200 mM NaCl）平衡层析柱。
17. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析含蛋白的组分。

3. 病毒特异性核衣壳的体外组装

注意： RSV特异性核衣壳（N:RNA）的体外组装是通过将制备好的N0P复合物与RNA寡核苷酸孵育来完成的。随后，采用尺寸排阻色谱法（SEC）将组装后的复合物与未结合的N0P及过量RNA分离（图2）。

1. 将纯化的 N0P 复合物与 RNA 寡核苷酸按 1:1.5 的摩尔比混合，在室温下孵育 1 小时，通常使用 1 mL 浓度为 1 mg/mL 的 N0P 蛋白即可用于下一步。设置对照样品，其中仅含有等量的 N0P 蛋白。
2. 用缓冲液 E（20 mM HEPES，pH 7.4，200 mM NaCl）预先平衡凝胶过滤 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱。
3. 以 21,130 × g 离心样品 15 分钟，去除沉淀后将上清液上样至 SEC 柱。
4. 比较 N:RNA 组装样品与 N0P 对照样品的 SEC 层析图谱，结合 A260/A280 比值，确定哪些峰对应组装的 N-RNA、N0P 和游离 RNA。
5. 收集各峰组分，进行 SDS-PAGE 电泳或制备电镜载网。
6. 对于组装的 N-RNA 复合物，收集 N-RNA 峰的所有组分，进行 RNA 提取并运行尿素-PAGE 电泳，以再次确认特定 RNA 的长度是否与第一步中混合并孵育的 RNA 一致。

结果

图1. 质粒构建示意图。 A. RSV N1-391的构建；B. RSV P1-126的构建；C. 用于共表达N1-391和P1-126的双顺反子构建体。第一个基因RSV N1-391、第二个基因RSV P1-126、抗生素抗性基因（AmpR）以及启动子分别用黄色、青色、粉色和橙色方框标出。综上所述，RSV N1-391和RSV P1-126的基因插入片段被分别构建后进行组装。

图2. 蛋白复合物N1-391P1-126的纯化流程图。该流程包括大肠杆菌（E. coli）菌液的接种与大规模培养，以及通过离心收集菌体细胞。随后进行细胞裂解，蛋白样品依次经过亲和层析（即Co²⁺柱）、离子交换层析（即Q柱）和凝胶过滤尺寸排阻（SEC）层析进行纯化。最后通过SDS-PAGE凝胶对蛋白样品进行进一步分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	SIgma	A9539-500G	使用LIC方法构建质粒
氨苄青霉素钠	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	细胞培养用抗生素
AseI	NEB	R0526S	使用LIC方法构建质粒
钴（高密度）琼脂糖珠	Gold Bio	H-310-500	用于纯化带His标签的蛋白
Corning LSE 数字干浴加热器	CORNING	6885-DB	加热样品
dCTP	Invitrogen	10217016	使用LIC方法构建质粒
dGTP	Invitrogen	10218014	使用LIC方法构建质粒
甘油	Sigma	G5516-4L	配制溶液
HEPES	Sigma	H3375-100G	配制溶液
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	蛋白纯化
咪唑	Sigma	I5513-100G	配制溶液
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷）	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	诱导蛋白表达
微量离心管	VWR	47730-598	用于PCR
Misonix Sonicator XL2020 超声波液体处理器	SpectraLab	MSX-XL-2020	用于细胞裂解的超声仪
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	用于细胞培养的摇床
Nonidet P-40 替代物	Sigma	74385-1L	配制溶液
OneTaq DNA聚合酶	NEB	M0480L	PCR
QIAquick 凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28706	纯化DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	使用LIC方法构建质粒
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	蛋白纯化
T4 DNA聚合酶	Sigma	70099-3	使用LIC方法构建质粒
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus 离心机	Fisher Scientific	36-101-0816	离心机，最高转速20,000 rpm
Trizma盐酸盐	Sigma	T3253-250G	配制溶液