利用免疫细胞化学法检测寨卡病毒双链RNA复制中间体

摘要

来源：Contreras, D., et al. 寨卡病毒体外感染细胞培养系统及干扰素的体外预防作用。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用免疫细胞化学方法检测感染的上皮细胞中寨卡病毒的双链RNA（dsRNA）中间产物。感染的细胞经固定后，使用封闭液进行封闭。随后加入一抗和二抗。细胞核用荧光染料染色，最后在荧光显微镜下观察标记的病毒dsRNA。

方案

1. 寨卡病毒基因组复制检测

1. 使用12孔板，以每孔2 ml体积接种1 × 10⁵个细胞的未处理Vero细胞。次日，用无血清培养基制备低滴度和高滴度病毒接种物（感染复数（MOI）分别为0.01和0.1；每孔400 µl），设三个重复。对于模拟感染，仅使用无血清培养基（每孔400 µl）。
2. 将接种后的培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育4–6小时。每隔1小时轻轻倾斜培养板使接种液均匀分布。
3. 孵育结束后，弃去接种液，更换为含血清培养基（每孔2 ml）。
4. 在48小时和96小时时间点，收集样本用于免疫细胞化学（ICC）检测。
5. 使用甲醇固定的细胞进行ICC检测。
   1. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤固定后的细胞3次，并用ICC封闭缓冲液（含3%山羊血清、3%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Triton-X 100的PBS）封闭。
   2. 在封闭缓冲液中按1:100稀释小鼠单克隆抗dsRNA抗体J2（1 µg/ml），加入后4 °C孵育过夜。
   3. 用1× PBS洗涤细胞，再在封闭缓冲液中按1:1,000稀释二抗山羊抗小鼠IgG-594（1 µg/ml），室温孵育1小时。
   4. 用1× PBS洗涤细胞，使用Hoechst染料对细胞核染色，并在荧光显微镜下以100倍放大倍数观察细胞（图1）。

结果

图1： 用于评估寨卡病毒（ZIKV）复制的检测方法。（A）该图显示通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）测定的寨卡病毒基因组含量。泛基因型（ZIKV GEN）和PRVABC59毒株特异性（ZIKV UNI）引物表现出相等的灵敏度和特异性。如预期，丙型肝炎病毒（HCV）引物未扩增出任何产物。（B）该图展示了在指定时间点低滴度和高滴度感染细胞中寨卡病毒的生长动力学，与未感染的模拟对照组相比。数据以均值±标准差表示。（C）用于研究病毒复制的免疫细胞化学检测。寨卡病毒感染的细胞被dsRNA抗体特异性染色。在感染后48小时，感染细胞呈少数簇状分布；而在感染后96小时，大多数细胞已被感染。使用Hoechst染料对细胞核进行染色以实现可视化（比例尺 = 50 µm）。BF：明场图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
小鼠单克隆抗双链RNA抗体 J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Vero 细胞系	ATCC	CCL-81
寨卡病毒株 PRVABC59	美国疾病控制与预防中心（CDC）
配备 Nikon Intenselight C-HGFI 的尼康 Eclipse Ti 免疫荧光显微镜	Nikon	Visit Nikon for Request