病毒颗粒的浓缩与纯化

摘要

来源：Fricano-Kugler, C. J., 等．通过立体定位注射设计、包装和递送高滴度CRISPR逆转录病毒和慢病毒．J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了从含有宿主细胞碎片的混合悬液中浓缩和纯化慢病毒颗粒的逐步操作过程。该方法利用离心、过滤以及聚乙二醇-盐沉淀技术来分离病毒颗粒，同时去除可溶性杂质。最终产物用缓冲液重悬，并在超低温条件下保存，以维持病毒的感染性和结构完整性。

方案

1. 病毒的浓缩与纯化

1. 通过将40%聚乙二醇6000和1.5 M NaCl加入ddH₂O中，配制5倍浓度的聚乙二醇6000溶液。在121 °C条件下，使用液体循环程序高压灭菌该溶液45分钟。冷却过程中缓慢混匀。
   注意：溶液初始呈浑浊状态，随着冷却逐渐变澄清。
2. 将含有两份病毒上清液的50 ml锥形管在2,000 × g离心10分钟，以沉淀不溶性物质。通过0.45 µm低蛋白结合注射式滤器（PES或PVDF）过滤，纯化病毒培养基。
3. 向培养基中加入5倍浓度的聚乙二醇6000溶液（最终浓度应为8%聚乙二醇6000和0.3 M NaCl）。反复倒置试管数次进行混匀（切勿涡旋）。将含病毒的聚乙二醇溶液在4 °C孵育12小时或更长时间，期间偶尔重新混匀。
4. （第9天）将含病毒的聚乙二醇溶液在2,500 × g离心45分钟。移除并弃去上清液，再次离心2分钟。再次移除并弃去上清液。
5. 加入320 µl无菌磷酸盐缓冲液重悬沉淀（320 µl为所收集含病毒培养基原始体积的1/100），并在4 °C过夜孵育。可选：在室温下置于摇床上重悬沉淀30分钟。
6. 重悬沉淀后，分装病毒（每0.5 ml离心管分装5–10 µl），并将分装样品在-80 °C冷冻保存（反复冻融或在4 °C储存会显著降低病毒滴度）。
7. 使用标准方案测定病毒滴度，即在6孔板的HEK293T细胞上进行系列稀释，并在48小时后人工计数荧光集落。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
转染试剂列表
5 ml 聚苯乙烯管	Fisher Scientific	352054
聚乙二醇 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) 磷酸盐缓冲液 (PBS)	National Diagnostics	CL-253
0.5 ml 微量离心管	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A