病毒蚀斑实验中液体覆盖系统的评估

来源：Baer, A. 和 Kehn-Hall, K. 通过空斑实验测定病毒浓度：传统与新型覆盖系统的应用。J. Vis. Exp. (2014)。

本视频通过比较一种基于液体微晶纤维素的覆盖物与传统的半固体琼脂糖覆盖物在病毒斑形成中的有效性，展示了基于液体微晶纤维素的覆盖物在斑点分析中的应用。

1. 细胞和试剂的准备

实验前一天，将目标病毒的适当宿主细胞接种于培养板中（表1 和表2) 在细胞融合度为 90 - 100% 时。
配制含10%甲醛的固定液于H₂例如，将5.56 ml的36%甲醛储备液与14.44 ml的蒸馏水混合₂O（dH₂O）₂O)
注意： 使用甲醛时，应采取适当的安全操作规范和通风措施。
配制结晶紫染色液：将1%结晶紫（CV）溶于20%乙醇和dH₂O中₂O.
制备2倍浓度的斑块培养基（根据细胞类型确定2倍浓度；参见表2）。使用滤器过滤 0.2 µm 若任何试剂不无菌，则需过滤。
固定覆盖物的制备（表3)
1. 对于液体覆盖层，配制含2.4% Avicel的无菌溶液于dH₂O中₂O. 为防止结块，将粉末缓慢加入含有水的烧瓶中，同时使用搅拌子快速搅拌，并在室温（RT）下快速搅拌。当溶液变得过于黏稠而无法用搅拌子混匀时，改用烧瓶摇床进行混合。 >30分钟剧烈振荡，以确保均匀均质化。
  注意： 储备液可配制为较低浓度，但可能会发生分层，需重新混匀以确保均一性。可使用浓度范围为0.6%-3%的Avicel工作液。
2. 匀浆后，将溶液高压灭菌，并密封保存于室温。
3. 对于琼脂糖和羧甲基纤维素（CMC）覆盖层，用dH₂O配制储存液₂2% CMC 或 0.6% 琼脂糖溶液。使用搅拌子混匀，并通过高压灭菌或微波加热使其完全溶解。

2. 稀释与感染

接种后第二天，在开始实验前目视检查细胞的融合度和存活率。确保细胞形态正常，并形成约90%融合的单层细胞。
对感染性样品进行10倍系列稀释。使用适用于病毒增殖的细胞培养基作为稀释液（表2）。根据待测病毒的预期滴度调整所需稀释倍数，并始终设置未感染的对照样品，以独立确认细胞存活率并辅助斑块识别。
从系列稀释液中取样，感染细胞45分钟至1小时（表1）。使用足量的接种物覆盖细胞，同时尽可能降低体积，以最大化病毒与单层细胞的接触（表4）。每隔20分钟轻轻摇动培养板，确保接种物分布均匀，并防止单层细胞干燥。
感染完成后，直接向孔中的接种物加入适量的固定化培养基作为覆盖层（表2），使用2倍浓度斑块培养基与所选固定化覆盖物（CMC、琼脂糖或Avicel）按1:1比例混合。轻轻摇动以混匀。
1. 对于液体覆盖层，将预热的2倍浓度斑块培养基与室温下1.2–2.4%的Avicel储备液按1:1比例混合，得到终浓度为0.6–1.2% Avicel的工作覆盖液。
2. 对于琼脂糖覆盖层，将预热的2倍浓度斑块培养基与加热后的0.6%琼脂糖储备液按1:1比例混合，置于56 °C水浴中平衡温度30分钟，最终获得0.3%的琼脂糖/覆盖层浓度。
3. 对于CMC，配制2%的储备液，并参照琼脂糖覆盖层的方法进行处理。
4. 将覆盖层加至单层细胞时，始终将热的琼脂糖或CMC置于56 °C水浴中平衡温度，以防止损伤单层细胞。确保溶液温热但不烫手，以避免细胞死亡和病毒滴度降低。大多数琼脂糖覆盖层在低于42 °C时开始凝固，操作时应迅速进行，或分批少量配制，以防处理过程中发生凝固。
加入覆盖层后，将培养板放入培养箱中孵育，以形成清晰可计数的独立斑块。斑块形成时间根据所分析病毒的不同，可能需要2–14天（表1）。
注意：液体覆盖层的培养板一旦放入培养箱后，切勿移动。孵育期间移动会导致斑块模糊。琼脂糖和CMC覆盖层为半固体，可在孵育期间定期移动或在光学显微镜下检查，以监测斑块发育情况。

3. 固定与染色细胞

为固定细胞，倾倒或吸除Avicel覆盖层，并使用10%甲醛溶液固定细胞30分钟至过夜（<6 孔板每孔 1 ml
1. 对于琼脂糖或羧甲基纤维素，直接将甲醛溶液加入覆盖物中，作用1小时或过夜。
  注意： 样品可在固定剂中长期保存，前提是固定剂不发生蒸发和干燥，否则可能导致单层细胞变形。
固定后、染色前，弃去甲醛，并用流水或刮铲手动移除琼脂糖和羧甲基纤维素（CMC）的半固体凝胶块。染色前，用水冲洗Avicel噬斑，以去除残留的覆盖层/固定剂。
染色时，用少量结晶紫溶液覆盖细胞，孵育约15分钟。必要时轻轻摇动培养板，以确保染色均匀。
用清水轻轻洗去结晶紫染色。固定、染色并干燥后，可将噬斑长期保存以供后续分析。

表1. 空斑实验接种条件与细胞类型

	RVFV	VEEV	流感B
细胞类型	Vero	Vero	MDCK
感染时间	1 hr	1 hr	45 min
孵育时间	3 days	2 days	3 days

表2. 斑块及病毒/细胞生长培养基

	裂谷热病毒（RVFV）	委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）	乙型流感病毒
细胞类型	Vero	Vero	MDCK
生长培养基	DMEM¹	DMEM¹	DMEM²
蚀斑培养基	2xEMEM^A	2xEMEM^A	2xEMEM^B

1. 添加10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基。

2. 添加1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素、0.2% 牛血清白蛋白、0.025% HEPES 和50 µg/ml DEAE-葡聚糖的杜氏改良伊格尔培养基。

A. 2倍最低必需培养基（500 ml），添加5% 胎牛血清（25 ml）、1% 最低必需氨基酸（5 ml）、1% 丙酮酸钠（5 ml）、1% L-谷氨酰胺（5 ml）、2% 青霉素-链霉素溶液（10 ml）。

B. 2倍最低必需培养基（500 ml），添加0.2%牛血清白蛋白、1%最低必需氨基酸（5 ml）、50 µg/ml DEAE-葡聚糖、TPCK处理的胰蛋白酶*

*在准备前立即向用于与琼脂糖混合形成噬斑的等分试样中，每 25 ml 加入 1 µl 的 2 µg/ml TPCK-胰蛋白酶储备液。

表3. 悬液储备液

	RVFV	VEEV	流感B
细胞类型	Vero	Vero	MDCK
感染时间	1 hr	1 hr	45 min
孵育时间	3 days	2 days	3 days

表4. 培养皿规格

	6 孔板	12 孔板	96 孔板
每孔细胞数	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
接种物体积 (μl)	400	200	50
覆盖液体积 (ml)	3	1.5	0.100

姓名	公司	目录编号	评论
结晶紫	Sigma Aldritch	C3886-25G
甲醛溶液	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	重新配制时需剧烈振荡 >30 分钟以实现均质化
UltraPure 琼脂糖	Invitrogen	16500-100
羧甲基纤维素钠盐中等黏度	Sigma Aldrich	C4888

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