计算机辅助的大规模胰岛质量、大小分布及结构的可视化与定量分析

摘要

本文描述了用于大规模获取和分析免疫组织化学染色胰腺标本的新型计算机辅助方法：（1）整张切片的虚拟切片采集；（2）大规模数据的批量分析；（3）二维虚拟切片的重建；（4）胰岛的三维定位绘图；以及（5）数学分析。

摘要

胰岛是一种独特的微器官，由多种分泌激素的内分泌细胞组成，例如β细胞（胰岛素）、α细胞（胰高血糖素）和δ细胞（生长抑素），这些细胞嵌入外分泌组织中，占整个胰腺的1-2%。机体体重与胰腺重量之间存在密切的相关性。总的β细胞质量也成比例地增加，以满足机体对胰岛素的需求。然而，胰岛的大小分布并不遵循这种成比例的扩张规律。大型动物（如人类）与小鼠具有相似的胰岛大小分布，这表明该微器官的功能发挥存在一定的尺寸限制。大型动物胰腺无法产生相应更大的胰岛，而是通过增加胰岛数量以及在其总体胰岛大小分布中增大较大胰岛的比例来代偿。此外，不同物种之间，以及同一物种在不同病理生理条件下，胰岛在细胞组成和结构架构上均表现出显著的可塑性。在本研究中，我们描述了用于分析生物图像数据的新方法，以促进分析过程的自动化，从而实现对大规模且异质的数据集进行分析，以研究此类动态生物过程和复杂结构。由于在无偏采样和技术上生成大规模数据集方面存在困难，此类研究一直受到阻碍，难以精确捕捉胰岛生物学中生物过程的复杂性。本文展示了在样本数量有限（或为最小化样本采集）以及标准实验条件下，如何获取无偏的“代表性”数据，并精确分析胰岛复杂的三维结构。计算机辅助自动化不仅能够实现大规模数据集的收集与分析，还能确保对数据的无偏解释。此外，对胰岛大小分布和空间坐标（即X、Y、Z位置）的精确定量，不仅能实现胰岛结构与组成的准确可视化，还可通过数学建模帮助我们识别发育过程中以及适应变化条件时的规律模式。本研究开发的方法同样适用于许多其他系统和生物体的研究。

方案

1. 创建免疫组织化学染色图像的虚拟切片

1. 打开 StereoInvestigator。将载有样本的洁净载玻片放入显微镜载物台，在软件中点击“采集”然后选择“实时图像”（Acquisition→ Live Image）进行观察。确定每个通道的曝光水平；在本示例中，通道2用于DAPI，通道3用于GFP，通道4用于RFP，通道5用于Cy5，通道6用于Cy7。使用显示荧光强度的“视频直方图”窗口来确定曝光水平。当视频直方图右侧末端的强度逐渐减弱时，即达到合适的荧光强度。曝光水平可在“相机设置”窗口中调整。视频直方图可通过显微镜的调焦旋钮进行聚焦。
2. 在创建虚拟切片前，通过在远离样本的屏幕位置点击以标记参考点，然后沿样本轮廓点击来勾勒样本。完成轮廓绘制后，单击右键并选择“关闭轮廓”以连接起始点和终点。
3. 轮廓闭合后，为样本捕获虚拟切片（采集→获取虚拟切片）。当虚拟切片窗口选项打开时，选择“高速采集”，并通过取消勾选“手动”旁边的复选框启用自动对焦。保存文件。
4. 虚拟切片预聚焦必须通过在虚拟切片预览中选择（右键点击→添加到聚焦位点列表）并手动聚焦多个随机区域（即位点）来进行校准。完成多个位点的聚焦后，启动虚拟切片（右键点击→使用预聚焦启动虚拟切片）。第一个样本的虚拟切片完成后，切换至下一个通道并相应调整曝光时间。对每个通道重复步骤4和5。

2. 计算机辅助二维分析

讨论

本文所介绍的计算机辅助大规模可视化与定量分析方法在胰岛研究中具有四个关键意义：（1）对胰腺样本进行大规模分析，可全面了解整体胰岛大小分布及胰岛结构特征；（2）对细胞组成和结构进行三维重建与数学分析，有助于进一步研究胰岛内内分泌细胞的空间排列；（3）不同物种之间以及同一物种在不同病理生理条件下所表现出的显著胰岛可塑性，可能提示其为应对代谢变化而进化获得的适应性特征，而非单纯的物种差异；（4）内分泌细胞组成和胰岛结构的重组，伴随某些基因表达的变化，可能反映了胰岛功能特性的适应性调整，进一步表明胰岛内内分泌细胞网络在其功能中具有重要意义。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光显微镜	显微镜	Olympus Corporation	IX-81
Stereo Investigator	程序	MBF Bioscience
MIP-GFP 小鼠	小鼠	Jackson Laboratory
Mathematica	程序	Wolfram
Image J	程序	美国国立卫生研究院
Slidebook		程序	Olympus