本文描述了用于大规模获取和分析免疫组织化学染色胰腺标本的新型计算机辅助方法：（1）整张切片的虚拟切片采集；（2）大规模数据的批量分析；（3）二维虚拟切片的重建；（4）胰岛的三维定位绘图；以及（5）数学分析。
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本文内容
摘要
摘要
胰岛是一种独特的微器官，由多种分泌激素的内分泌细胞组成，例如β细胞（胰岛素）、α细胞（胰高血糖素）和δ细胞（生长抑素），这些细胞嵌入外分泌组织中，占整个胰腺的1-2%。机体体重与胰腺重量之间存在密切的相关性。总的β细胞质量也成比例地增加，以满足机体对胰岛素的需求。然而，胰岛的大小分布并不遵循这种成比例的扩张规律。大型动物（如人类）与小鼠具有相似的胰岛大小分布，这表明该微器官的功能发挥存在一定的尺寸限制。大型动物胰腺无法产生相应更大的胰岛，而是通过增加胰岛数量以及在其总体胰岛大小分布中增大较大胰岛的比例来代偿。此外，不同物种之间，以及同一物种在不同病理生理条件下，胰岛在细胞组成和结构架构上均表现出显著的可塑性。在本研究中，我们描述了用于分析生物图像数据的新方法，以促进分析过程的自动化，从而实现对大规模且异质的数据集进行分析，以研究此类动态生物过程和复杂结构。由于在无偏采样和技术上生成大规模数据集方面存在困难，此类研究一直受到阻碍，难以精确捕捉胰岛生物学中生物过程的复杂性。本文展示了在样本数量有限（或为最小化样本采集）以及标准实验条件下，如何获取无偏的“代表性”数据，并精确分析胰岛复杂的三维结构。计算机辅助自动化不仅能够实现大规模数据集的收集与分析，还能确保对数据的无偏解释。此外，对胰岛大小分布和空间坐标（即X、Y、Z位置）的精确定量，不仅能实现胰岛结构与组成的准确可视化，还可通过数学建模帮助我们识别发育过程中以及适应变化条件时的规律模式。本研究开发的方法同样适用于许多其他系统和生物体的研究。
方案
1. 创建免疫组织化学染色图像的虚拟切片
- 打开 StereoInvestigator。将载有样本的洁净载玻片放入显微镜载物台，在软件中点击“采集”然后选择“实时图像”（Acquisition→ Live Image）进行观察。确定每个通道的曝光水平；在本示例中，通道2用于DAPI，通道3用于GFP，通道4用于RFP，通道5用于Cy5，通道6用于Cy7。使用显示荧光强度的“视频直方图”窗口来确定曝光水平。当视频直方图右侧末端的强度逐渐减弱时，即达到合适的荧光强度。曝光水平可在“相机设置”窗口中调整。视频直方图可通过显微镜的调焦旋钮进行聚焦。
- 在创建虚拟切片前，通过在远离样本的屏幕位置点击以标记参考点，然后沿样本轮廓点击来勾勒样本。完成轮廓绘制后，单击右键并选择“关闭轮廓”以连接起始点和终点。
- 轮廓闭合后，为样本捕获虚拟切片（采集→获取虚拟切片）。当虚拟切片窗口选项打开时，选择“高速采集”，并通过取消勾选“手动”旁边的复选框启用自动对焦。保存文件。
- 虚拟切片预聚焦必须通过在虚拟切片预览中选择（右键点击→添加到聚焦位点列表）并手动聚焦多个随机区域（即位点）来进行校准。完成多个位点的聚焦后，启动虚拟切片（右键点击→使用预聚焦启动虚拟切片）。第一个样本的虚拟切片完成后，切换至下一个通道并相应调整曝光时间。对每个通道重复步骤4和5。
2. 计算机辅助二维分析
胰岛的定量分析
- 随后使用名为“IHCVS”的ImageJ宏处理图像，该宏首先对加载的图像进行分析前准备，然后定量分析胰岛的特征，例如细胞组成（即β细胞、α细胞和δ细胞群体各自的面积，以及胰岛总面积的总和值）。在ImageJ中将图像堆栈拆分为各个独立通道，每个通道显示基于免疫组化染色结果的单独图像。每个图像随后被自动设定阈值，生成一幅8位黑白图像（即阈值化图像的掩膜）。然后将各个通道图像通过算术相加合并为一幅复合掩膜，并对复合图像执行ImageJ内置的颗粒分析功能。
- 接着识别感兴趣区域（ROI），同时排除小于单个β细胞的颗粒（<170 μm2；面积按直径约15 μm计算；Hara et al., 2003）。所得的ROI通过ImageJ进行分析与定量，定量参数可包括周长（围绕某一区域的边界距离）、圆形度（反映圆整程度，数值1.0表示完美圆形）、Feret直径（区域内最长距离）以及每个分析区域的中心坐标，以便利用这些参数的不同组合对胰岛分布进行数学分析，并绘制三维图，所得数据可用于数学建模。单张虚拟切片图像的分析耗时约30秒。通过将图像处理与分析脚本嵌入ImageJ宏语言支持的循环语法中，可批量分析多张图像。该循环会打开指定目录中的所有文件，逐一分析图像，并将结果输出至新位置，保存为Excel文件。
- 汇总结果保存至Excel电子表格中，存储每个胰岛的面积、周长、圆形度、Feret直径和胰岛中心坐标等数据，同时包含图像中标注的相应编号。
计算分析与直方图设置
- Mathematica 脚本在启动后可自动运行，用于处理所收集的电子表格数据，数据量达数十万条。其中一项关键的处理过程是频率分析，该分析可生成直方图，用于检查尺寸分布并确定数据中的异常值。在脚本运行过程中，将测量总胰岛面积，并将其与其他参数（特别是时间点或胰腺年龄）进行比较，然后相应地以图形形式展示结果。
3. 二维免疫组织化学染色虚拟切片图像的三维重建
虚拟切片的三维重建
- 将脚本（“im_jp2_2_tiff”）复制到包含 jp2 图像的目录（即文件夹）中。在 Linux 命令行终端中运行该脚本，输入“./im_jp2_2_tiff”后按回车键。运行此脚本将自动将目录中的所有 jp2 图像转换为 tiff 文件，该格式用于从虚拟切片构建和量化三维图像堆栈。（注意：如果脚本无法运行，请输入“chmod +x im_jp2_2_tiff”，该命令会将文本文件转换为可执行脚本，使其能够正常运行。）
- 当所有采集的图像均从 jp2 格式转换为 tiff 格式后，即可用于 ImageJ 中的分析。
- 在 ImageJ 中，打开第一个样本的所有图像（本例中为五幅图像：DAPI、GFP、RFP、Cy5、Cy7），并将它们合并为一幅图像（图像→ 颜色→ 合并通道）。对每个样本重复此过程。当所有样本均合并为单幅图像后，使用“多边形选区”工具选择不需要的区域，并进行填充（编辑→ 填充）以清理图像。（如有必要，可将图像调整为更小尺寸。）然后将每幅图像转换为 RGB 彩色图像（图像→ 类型→ RGB 颜色）。最后，将图像创建为堆栈（图像→ 堆栈→ 图像到堆栈），如有需要，可进一步使用“Stack Reg”插件进行对齐。最终，通过合并通道并组合图像，可生成整个胰腺中所有胰岛的三维拼合图像。要查看图像，请点击“插件”然后选择“3D 查看器”。
4. 胰岛图谱绘制
采集图像序列
- 将完整胰岛组织置于显微镜下。
- 打开 Slidebook 软件。按下“Ctrl+Shift+E”进入“图像采集与聚焦控制”界面。在“聚焦控制”窗口中，根据胰岛的大小选择 20X 或 40X 物镜。若使用水浸物镜，需滴加水。
- 为了使用显微镜目镜定位胰岛，需在“Focus Controls”窗口中将“Bin”设置为2X，将滤光片组设置为User1。“Emission Selection”应设置为100% Eyes，中性密度设置为1。点击“GFP ey”，然后点击“Open Fluor”。
- 在 Slidebook 中可视化样本时，返回“Focus Controls”窗口，将“Filter Set”切换至“Live”，然后点击“GFP ds”。使用操纵杆尽可能将胰岛置于 Camera 1 窗口的中心位置。调节焦距至胰岛中心附近的深度，以便清晰分辨细胞。
- 在“对焦控制窗口”中，选择“Z 选项卡”。点击窗口左上角的“设置”，将当前深度设为参考点。使用显微镜控制功能滚动至可清晰分辨胰岛结构的最上层深度，然后点击“设为顶部”。滚动至胰岛底部，点击“设为底部”。点击“返回”以回到参考点。
- 在"捕获"窗口中，将"像素合并系数"设为"2X"，并将"滤光片组"设为"实时"。将"捕获类型"设置为"3D"（且仅限3D）。在窗口右侧，点击"使用顶部与底部位置"。点击"捕获后返回参考点"。将"步进尺寸"设为"3"。
- 在“滤光片组框”下方，选择 DAPI dsu、GFP dsu、RFP dsu 和 Cy5 Dsu。对每一项，点击“调整曝光”下的“寻找最佳”，然后点击“测试”以确保所选曝光合适。点击“开始”以启动图像采集。
- 当捕获完成后，根据需要调整灰度水平，并将RFP的显示颜色更改为白色。保存幻灯片，然后进入“查看”→“导出”→“TIFF序列”。输入幻灯片名称，并在末尾添加一个短横线，然后保存。系统将生成数十个单独的TIFF文件，因此建议将每个胰岛的图像堆栈保存在独立的文件夹中。
图像堆栈映射
- 打开 Stereo Investigator 软件。通过打开图像堆栈（文件 → 图像堆栈 → 打开图像堆栈）来查看图像。在“图像缩放”菜单中，将“图像间距离”设置为 3.00 μm。为校正 Slidebook 中的 2X binning，请选中“覆盖 X 和 Y 缩放”以及“X 和 Y 缩放来源”中的“用户指定”，并在 X 和 Y 项中均输入 0.65。
- 在“宏观窗口”中点击目标胰岛的中心位置以居中图像。使用相应的标记工具标记至少一个细胞。β细胞显示为绿色，α细胞显示为红色，δ细胞显示为白色；使用标记 2（空心圆）标记 β 细胞，标记 5（空心三角形）标记 α 细胞，标记 6（空心三角形）标记 δ 细胞。细胞应在其细胞核中心处标记，若样本经 DAPI 染色，则细胞核呈蓝色。
- 标记至少一个细胞后，使用顶部菜单中的图标显示“正交视图”。勾选“Z-滤波”和“对称”选项，范围设置为 15.00。从 Z = 0.0 层开始，使用鼠标滚轮滚动浏览胰岛结构，并使用相应标记对每个细胞进行标记。每个细胞仅在其深度中心标记一次。完成所有 Z 层的标记后，可取消勾选“Z-滤波”复选框，以显示所有 Z 层的全部标记。
- 当所有细胞均被标记后，将文件保存为“DAT”格式，然后进入 文件 → 导出轨迹，将轨迹数据保存为“TXT”文件。点击“新建数据文件”以清除工作区，再进行下一个胰岛的映射操作。
5. 代表性结果：
通过对免疫组织化学染色的胰腺样本制备虚拟切片，可以全面观察整个胰腺中的所有内分泌细胞（α细胞、β细胞和δ细胞），既可将其作为胰岛整体进行观察（图1A），也可在独立的通道中分别观察单个细胞（图1B）。借助计算机程序和脚本，可对这些虚拟切片进行大规模数据的批量分析。具体而言，通过对复合掩膜进行颗粒分析（图1C），输出包含每个被检测胰岛参数的统计表格，参数包括胰岛面积、周长（围绕区域的距离）、圆形度（圆度程度，其中1.0代表完美圆形）以及Feret直径（区域内最长距离）（图1D）。对这些图像的大规模分析可生成胰岛总数及大小分布直方图，并实现α细胞、β细胞和δ细胞面积的详细比较。此外，每张虚拟切片的深度约为5 μm，所有独立的二维虚拟切片进一步叠加，以构建整个胰腺样本的三维重建图像。胰岛定位映射不仅实现了胰岛的三维成像，还展示了计算机辅助分析的另一应用实例。胰岛映射包括识别并捕获独立的胰岛（图2A），随后在不同的Z平面标记α细胞、β细胞和δ细胞（图2B），以实现胰岛的三维可视化（图2C，D）。对定位映射后的胰岛进行自动化数学分析，可揭示其细胞组成和空间结构特征，包括细胞间距离（图2E）以及细胞间距离分布的累积概率（图2F）。
图 1. 利用虚拟切片技术大规模捕获与分析胰岛分布。A. 人胰腺组织切片的虚拟切片视图。a. 胰岛素（绿色）、胰高血糖素（红色）、生长抑素（白色）的免疫组织化学染色及DAPI（蓝色）复染。b. 经自动阈值处理后生成的8位掩膜图像。框选区域在B图中放大显示。B. 各荧光通道的单独视图。a. δ细胞，b. β细胞，c. α细胞，以及d. 合成的合并图像。C. 对合并掩膜进行的颗粒分析。请注意，每个胰岛结构（包括小细胞簇）均被编号（蓝色高亮）。D. 针对各个独立结构测量所得多种参数的统计表格，其编号与C图中标注的标签相对应。
图 2. 免疫组织化学虚拟切片的分析。A. 图 1 的三维散点图，显示根据面积、圆形度和 Feret 直径等参数得出的各个胰岛的大小和形状分布。B. 图 1 的三维散点图，显示胰岛的细胞组成和大小。C. 基于图 1 对整个人类组织切片进行分析所得的胰岛大小分布，拟合为对数正态概率密度分布。D. 对图 1 中每个有效直径区间的胰岛，进行细胞组成比例的数学分析（β细胞为绿色，α细胞为红色，δ细胞为蓝色）。E. a. 随机取样免疫组织化学分析的胰岛大小分布（左图）；虚拟切片分析的胰岛大小分布（右图）。b. 随机取样免疫组织化学分析（红色）与虚拟切片（蓝色）的对数正态图比较。
图3. 胰岛细胞组成与结构的映射及数学分析。A：屏幕截图，显示从导入Stereo-Investigator的人类胰岛三维重建图像堆栈中提取的一个单一焦平面（β细胞为绿色，α细胞为红色，δ细胞为白色，细胞核为蓝色）。B：三个不同焦平面的荧光图像（左）及其对应的映射数据（右），各平面间隔10 μm。C：三维重建胰岛映射数据的代表性视图。D：基于胰岛映射所得坐标重建的四分之一切割胰岛的三维结构。E：细胞组成与结构的数学分析。左：同一细胞群内两个细胞之间细胞间距离的相对频率。右：不同细胞群之间两个细胞之间细胞间距离的相对频率。F：Kolmogorov-Smirnov（K-S）检验。左：α-α、β-β和δ-δ细胞间距离分布的累积概率。右：相应三个累积概率的K-S距离。
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讨论
本文所介绍的计算机辅助大规模可视化与定量分析方法在胰岛研究中具有四个关键意义：（1）对胰腺样本进行大规模分析，可全面了解整体胰岛大小分布及胰岛结构特征；（2）对细胞组成和结构进行三维重建与数学分析，有助于进一步研究胰岛内内分泌细胞的空间排列；（3）不同物种之间以及同一物种在不同病理生理条件下所表现出的显著胰岛可塑性，可能提示其为应对代谢变化而进化获得的适应性特征，而非单纯的物种差异；（4）内分泌细胞组成和胰岛结构的重组，伴随某些基因表达的变化，可能反映了胰岛功能特性的适应性调整，进一步表明胰岛内内分泌细胞网络在其功能中具有重要意义。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国公共卫生服务基金 DK-081527、DK-072473 和 DK-20595 项资助，该基金支持芝加哥大学糖尿病研究与培训中心（动物模型核心），以及科夫勒家族基金会的捐赠资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 荧光显微镜 | 显微镜 | Olympus Corporation | IX-81 | |
| Stereo Investigator | 程序 | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP 小鼠 | 小鼠 | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | 程序 | Wolfram | ||
| Image J | 程序 | 美国国立卫生研究院 | ||
| Slidebook | 程序 | Olympus |
参考文献
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition. ISLETS. 2, 135-145 (2010).
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. Islet architecture - a comparative study. ISLETS. 1, 129-136 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
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