通过向Drosophila胚胎注射dsRNA进行RNAi干扰

摘要

RNA干扰技术已被证明在分析Drosophila气管发育中基因功能方面非常有效。本文展示了姜实验室用于将dsRNA注射到果蝇胚胎中以敲低基因表达的详细实验方案。该技术有望用于筛选Drosophila组织和器官发育所必需的基因。

摘要

基因筛选是研究复杂生物过程最强大的方法之一 ¹多年来，可用于遗传操作的多种改进技术和工具相继出现 果蝇 ²在弗雷和梅洛最初发现后的不久 ³ 双链RNA可用于敲低单个基因的活性 秀丽隐杆线虫，RNA干扰（RNAi）被证明是一种强大的反向遗传学方法，可用于分析基因功能 果蝇 器官发育 ^{4, 5}.

许多器官，包括肺、肾、肝和血管系统，均由分支状管状网络构成，用于运输重要的液体或气体^{6, 7}。Drosophila气管形成的分析为研究其他管状器官的形态发生提供了一个极佳的模型系统⁸。伯克利Drosophila基因组计划已发现数百个在气管系统中表达的基因。为了研究管腔形成的分子与细胞机制，关键挑战在于理解这些基因在气管发育中的作用。本文中，我们描述了一种将dsRNA注射到Drosophila胚胎中的详细方法，以敲低特定基因的表达。我们通过dsRNA注射成功敲低了内源性dysfusion（dys）基因的表达。Dys是一种在气管融合细胞中表达的bHLH-PAS蛋白，对气管分支的融合至关重要^{9, 10}。dys-RNAi完全消除了dys的表达，并导致气管融合缺陷。这一相对简单的方法为鉴定Drosophila组织和器官发育所必需的基因提供了有力工具。

方案

1. 胚胎收集

1. 在 25°C 条件下设置培养笼，使用 2-4 日龄的 w¹¹¹⁸ 果蝇。在收集卵前 1-2 天期间，每天每小时更换一次葡萄汁培养基平板，以同步卵的收集时间
2. 在 25°C 条件下收集胚胎 1 小时
3. 切取一块矩形的葡萄汁琼脂，用刀片在其表面中央轻轻划一道浅痕，在琼脂上留下一条线
4. 使用金属探针将胚胎从葡萄汁平板转移至葡萄汁琼脂片上，将胚胎沿直线排列，使胚胎的长轴与琼脂中央的划线呈 45 度角。排列约 50 个胚胎形成一条直线。确保所有胚胎朝向一致，后端远离中央划线
5. 裁剪一块矩形双面胶带，将其贴附于 18×18 mm 盖玻片上
6. 用带有双面胶的盖玻片拾取胚胎
7. 将盖玻片放置于载玻片上，在空气中干燥胚胎约 10 分钟
8. 用一层薄的 700 号卤碳油覆盖胚胎，即可进行显微注射

2. 拉制针头

通过拉制玻璃毛细管来制备显微注射针。我们使用世界精密仪器公司（World Precision Instrument）的拉针仪（型号 PUL-1）。拉针仪的程序参数设置为：加热温度 1，延迟时间 4。

3. 填充针头

使用配备 Eppendorf Microloader 吸头的 Eppendorf p20 移液器反向装填针头，通常加载 1.5–2 μL 的 dsRNA

4. 折断针头

1. 在折断针尖之前，先将盖玻片放置在载玻片上。
2. 准备一张载玻片，在其中央滴加一滴油。
3. 打开Picospritzer III微注射仪，调节气压。
4. 将装有溶液的针头在盖玻片边缘轻轻折断，形成一个尖锐的针尖。
5. 当针尖断裂后，踩下Picospritzer III微注射仪的脚踏开关，部分dsRNA将从针尖处渗出。
6. 取出带有盖玻片的载玻片。
7. 将针头插入此前准备好的载玻片中央油滴下方。
8. 调节Picospritzer III微注射仪的设置，使踩下脚踏开关时释放出100–200 pl的dsRNA；此时dsRNA可见为微小液滴。

5. 注射

1. 将针尖移至第一个胚盘胚胎的后部，使其处于同一焦平面，并在偏离中心约卵长度30-50%的位置注射胚胎。
2. 踩下Picospritzer III微量注射泵的脚踏开关后，少量dsRNA将在注射部位呈现为一个小点。

6. 表型分析

1. 注射后，将载玻片放入盛有湿润滤纸的密闭塑料培养皿中，在18°C条件下孵育，直至胚胎发育至所需阶段。
2. 使用探针将胚胎从双面胶带上取下，并推至盖玻片边缘。
   用正庚烷将胚胎从载玻片上冲洗至底部带有尼龙滤网的收集管中，再用PBT洗涤3次。
   用50%次氯酸钠溶液脱膜5分钟，再用PBT洗涤3次。
   将胚胎从收集管转移至一片尼龙滤网上，然后将尼龙滤网浸入固定液（5ml 正庚烷、4.5ml PBS、0.5ml 37%甲醛）中以释放胚胎。在固定液中固定30分钟。
   用甲醇去卵黄膜，将胚胎转移至EP管中，并按照标准流程进行免疫染色。
3. 胚胎也可继续发育至适当的幼虫阶段。
4. 在载玻片中央滴加一滴Halocarbon 700油
5. 将一条幼虫转移至载玻片上，盖上盖玻片
6. 在明场显微镜下观察幼虫。

7. 代表性结果：

图1展示了在果蝇胚胎中通过dsRNA敲低dysfusion（dys）基因的一个示例。注射GFP-dsRNA的胚胎作为阴性对照。Dys是一种在气管融合细胞中表达的bHLH PAS转录因子。注射GFP-dsRNA的胚胎显示出正常的气管融合，且融合细胞中存在Dys蛋白（图1A）。另一方面，注射dys-dsRNA的胚胎表现出分支融合失败，且融合细胞中不存在Dys蛋白（图1B）。当注射dsRNA的胚胎发育至幼虫阶段时，与注射GFP-dsRNA的阴性对照（图1C）相比，注射dys-dsRNA的幼虫表现出分支融合失败（图1D）。这些结果表明，通过向Drosophila胚胎注射dsRNA可有效敲低内源性dys基因的表达。

图 1. 通过 dys-RNAi 去除 dys 功能揭示了气管融合缺陷。将囊胚期胚胎（w¹¹¹⁸）分别注射 GFP-dsRNA（阴性对照）或 dys-dsRNA，并检测其气管发育缺陷。（A）注射 GFP-dsRNA 的 16 期胚胎，经 α-Dys 和标记气管管腔的单克隆抗体 MAb 2A12 染色。图中显著显示的是已融合的侧支气管。箭头指示侧支气管中 Dys 阳性的融合细胞。（B）注射 dys-dsRNA 的 16 期胚胎，经 α-Dys 和 MAb 2A12 染色。该胚胎显示侧支气管未能融合（星号表示在对照胚胎中侧支气管融合的正常位置）。未观察到 Dys 阳性细胞，表明 dys-RNAi 有效消除了 Dys 蛋白。（C 至 D）通过明场显微镜观察注射 GFP-dsRNA 或 dys-dsRNA 的二龄幼虫，以评估气管缺陷。（C）在注射 GFP-dsRNA 的对照幼虫中，融合位点由星号标示。（D）在注射 dys-RNAi 的幼虫中，侧支气管未能融合，星号（*）表示侧支气管正常应融合的位置。

讨论

本文所介绍的dsRNA注射方法能够实现对基因功能的高度敏感且快速的分析 果蝇 气管发育。该方法有望用于分析其他组织和器官发育过程中的基因功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III 微量泵	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
微量移液器	Fisher Scientific	21170M
微量加样头	Eppendorf	930001007