通过向Drosophila胚胎注射dsRNA进行RNAi干扰

摘要

RNA干扰技术已被证明在分析Drosophila气管发育中基因功能方面非常有效。本文展示了姜实验室用于将dsRNA注射到果蝇胚胎中以敲低基因表达的详细实验方案。该技术有望用于筛选Drosophila组织和器官发育所必需的基因。

摘要

基因筛选是研究复杂生物过程最强大的方法之一 ¹多年来，可用于遗传操作的多种改进技术和工具相继出现 果蝇 ²在弗雷和梅洛最初发现后的不久 ³ 双链RNA可用于敲低单个基因的活性 秀丽隐杆线虫，RNA干扰（RNAi）被证明是一种强大的反向遗传学方法，可用于分析基因功能 果蝇 器官发育 ^{4, 5}.

许多器官，包括肺、肾、肝和血管系统，均由分支状管状网络构成，用于运输重要的液体或气体^{6, 7}。Drosophila气管形成的分析为研究其他管状器官的形态发生提供了一个极佳的模型系统⁸。伯克利Drosophila基因组计划已发现数百个在气管系统中表达的基因。为了研究管腔形成的分子与细胞机制，关键挑战在于理解这些基因在气管发育中的作用。本文中，我们描述了一种将dsRNA注射到Drosophila胚胎中的详细方法，以敲低特定基因的表达。我们通过dsRNA注射成功敲低了内源性dysfusion（dys）基因的表达。Dys是一种在气管融合细胞中表达的bHLH-PAS蛋白，对气管分支的融合至关重要^{9, 10}。dys-RNAi完全消除了dys的表达，并导致气管融合缺陷。这一相对简单的方法为鉴定Drosophila组织和器官发育所必需的基因提供了有力工具。

方案

1. 胚胎收集

1. 在 25°C 条件下设置培养笼，使用 2-4 日龄的 w¹¹¹⁸ 果蝇。在收集卵前 1-2 天期间，每天每小时更换一次葡萄汁培养基平板，以同步卵的收集时间
2. 在 25°C 条件下收集胚胎 1 小时
3. 切取一块矩形的葡萄汁琼脂，用刀片在其表面中央轻轻划一道浅痕，在琼脂上留下一条线
4. 使用金属探针将胚胎从葡萄汁平板转移至葡萄汁琼脂片上，将胚胎沿直线排列，使胚胎的长轴与琼脂中央的划线呈 45 度角。排列约 50 个胚胎形成一条直线。确保所有胚胎朝向一致，后端远离中央划线
5. 裁剪一块矩形双面胶带，将其贴附于 18×18 mm 盖玻片上
6. 用带有双面胶的盖玻片拾取胚胎
7. 将盖玻片放置于载玻片上，在空气中干燥胚胎约 10 分钟
8. 用一层薄的 700 号卤碳油覆盖胚胎，即可进行显微注射

2. 拉制针头

通过拉制玻璃毛细管来制备显微注射针。我们使用世界精密仪器公司（World Precision Instrument）的拉针仪（型号 PUL-1）。拉针仪的程序参数设置为：加热温度 1，延迟时间 4。

3. 填充针头

使用配备 Eppendorf Mic....

讨论

本文所介绍的dsRNA注射方法能够实现对基因功能的高度敏感且快速的分析 果蝇 气管发育。该方法有望用于分析其他组织和器官发育过程中的基因功能。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III 微量泵	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
微量移液器	Fisher Scientific	21170M
微量加样头	Eppendorf	930001007