一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

摘要

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。

摘要

出生后大脑中的神经发生依赖于三个生物学事件的维持：前体细胞的增殖、成神经细胞的迁移，以及新神经元向现有神经环路的分化与整合。在嗅球的出生后神经发生过程中，这些事件发生在三个解剖学上分离的区域：增殖主要发生在侧脑室的室下区（SEZ），成神经细胞通过吻侧迁移流（RMS）迁移，而新生成的神经元则在嗅球（OB）内完成分化与整合。这三个区域为分别研究调控各生物学事件的细胞、分子及生理机制提供了理想的平台。本文介绍了一种针对出生后脑组织优化的器官型脑片实验方法，该方法中的细胞外环境可高度模拟成神经细胞迁移的体内条件。我们证明，该实验体系可支持成神经细胞在吻侧迁移流中进行均匀、定向且快速的移动。通过利用不同遗传背景小鼠之间的交叉移植策略，该方法将非常适用于研究神经元迁移的细胞自主性与非自主性调控机制。

方案

一、实验步骤

以下操作应在无菌条件下，在层流罩中使用灭菌工具进行。

用于器官型切片的玻璃底培养皿的制备

1. 必须在无菌环境中使用灭菌工具制备培养皿。
2. 小心地将150μL切片培养基（见配方）滴加至培养皿玻璃底面的中央，注意避免培养基中产生气泡。
3. 使用配有23号针头的一次性注射器，将多点胶水（橡胶胶水 - Elmer's，货号# E904）涂布于方形边缘的四周，该边缘紧邻位于培养皿中央的圆形盖玻片，但需留出一侧不涂胶，以便后续液体交换（图1）。本方案中所列胶水类型在上述使用条件下对脑片或细胞无毒性。需特别注意避免将任何胶水沾到玻璃盖玻片上，否则会影响后续对脑片的成像观察。随后，使用微镊子将一张核孔膜（直径25mm，孔径8.0μm - Whatman，货号# 110614）放置在玻璃盖玻片上，并利用胶点固定其位置，操作时应确保玻璃盖玻片与膜之间无气泡残留。
4. 在膜上加入1 mL切片培养基。将培养皿置于培养箱中孵育30分钟，随后置于冰上，待用。

提取早期出生后大脑

当使用出生后幼鼠（P1-P10）制备脑片时，可获得最佳结果。

1. 幼崽通过异氟烷或其他经批准的方法进行终末麻醉（过量麻醉）。可用70%乙醇喷洒头部以提高无菌性，随后使用锋利的剪刀迅速断头。
2. 用显微镊夹住下颌以固定头部。从颈部至吻部纵向切开并去除皮肤。从枕大池开始，沿中线做1条正中切口和2条侧切口（每侧1条），纵向并向前切开颅骨（图2A）。移除颅骨瓣时应尽量减少与下方皮层组织的接触。
3. 为提高振动切片过程中组织的稳定性，通过两次矢状切口去除脑组织最外侧部分。同时在小脑前端基部进行切割，去除脑的尾侧部分（图2B）。
4. 沿中线裂进行平滑切割，将两个半球分离，并小心地将两半球从颅骨中取出，内侧面朝下放入包埋模具中（图2C-D）。

宿主大脑的切片

1. 将两个半脑立即浸入盛有融化态3%低熔点DNA级琼脂糖凝胶（Fisher，货号 BP1360-100）的包埋模具中，该琼脂糖溶于组织制备缓冲液，并维持在37°C（见配方）。在水平平面上静置2分钟以确保琼脂糖均匀凝固后，将模具置于冰上完成凝固过程。
2. 当含半脑的凝胶完全凝固后，将其从模具中取出并修整，使脑组织周围保留2–3 mm的凝胶。
3. 将包埋在凝胶中的组织固定于振动切片机的样品盘上，内侧朝上，并用氰基丙烯酸酯胶水（Krazy胶或等效产品）固定。需注意仅使用极少量胶水，因过量胶水会对切片及迁移细胞产生毒性作用；若胶水过多附着于组织块侧面，亦会阻碍切割过程，可能导致组织损伤。
4. 将样品盘安装至已盛满冰冻组织制备液的振动切片机样品槽中。
5. 使用振动切片机以150 μm厚度进行切片，切片速度设定为慢至中等范围（具体数值取决于所用振动切片机型号，需根据设备单独优化以获得最佳效果）。在本实验室条件下，振动频率设定为最大值时效果最佳。最初的几片切片可弃去。
6. 一旦含有RMS的切片从刀片上释放（RMS肉眼可见，呈灰白色U形结构，从SEZ延伸至OB），应小心将其从凝胶中分离，并用小型平头刮勺捞起。将切片转移至含切片培养基的玻璃底培养皿中的核孔膜上（图3A–B）。以典型的出生后早期小鼠脑为例，每半脑在150 μm厚度下可获得约2–3个含RMS的切片。操作切片时应尽量减少触碰，因其极为脆弱。随后将载有切片的培养皿转移至培养箱中。

供体脑切片与RMS移植

1. 将表达荧光报告基因的迁移性成神经细胞的供体脑组织切成250μm厚度的脑片，并收集于冰上预冷的组织制备缓冲液中。
2. 立即将脑片置于具备落射荧光功能的解剖显微镜下，使用显微镊子轻柔地显微解剖嗅侧脑室下区（RMS）。用一把镊子固定脑片，另一把镊子在RMS周围进行微小切割，直至将其从脑片中分离。随后将切除的RMS切成小块组织块（直径约200–500 μm），以备移植使用。
3. 从培养箱中取出含有宿主脑片并置于核孔滤膜上的玻璃底培养皿，放置于解剖显微镜下。在明场光照下清晰识别RMS，并在其起始段做一小切口。
4. 使用配备20 μL吸头的移液器，将一个供体RMS组织块转移至宿主RMS的切口处。轻柔地将组织块推入切口，使供体与宿主组织之间建立接触。为确保接触稳定，可将组织块略微推入脑片与核孔膜之间的间隙中。
5. 完成所有宿主脑片的RMS移植后，将培养皿放回培养箱中至少1小时，使脑片充分贴附于滤膜。约1–2小时后，成神经细胞应开始从移植组织块迁移进入宿主RMS。

神经元迁移的延时成像

1. 将玻璃底培养皿从培养箱转移至显微镜的孵育腔内（图3C）。可根据所需的分析类型，以0至10分钟的时间间隔对荧光标记的成神经细胞进行成像。例如，为观察单个成神经细胞迁移周期中的细胞骨架动态变化，我们将成像间隔设置为小于或等于2.5分钟。然而，对于细胞群体的迁移方向和速度等群体动态行为，则采用5至10分钟的间隔更为合适。物镜的选择因显微镜品牌而异。在尼康C1共聚焦显微镜上，我们发现20倍干镜（Nikon Pan Fluor，数值孔径0.75，工作距离0.35 mm）最适用于我们的分析。为在此共聚焦系统上获得最佳成像效果，应将针孔调整至中等大小（直径60 μm）。为获得最接近生理状态的迁移行为，成像应局限于位于纹状体-嗅球迁移路径（RMS）组织切片深层的细胞，即距离切片任一表面至少20 μm的区域。激光功率应优化至最低水平，同时确保单个成神经细胞的细节仍清晰可见。
2. 成像完成后，可将脑片用预冷的新鲜配制的4%多聚甲醛固定，进行免疫染色并封片，以供进一步成像分析。由于我们未在膜上涂布任何黏附基质（如层粘连蛋白），脑片在浸入染色缓冲液后通常会从膜上脱落。成像时应保持脑片原有的150 μm厚度。也可选择将脑片冷冻保存，并使用冷冻切片机对原始脑片进行更薄的切片。但这种方法可能增加染色伪影的发生率，并破坏组织的完整性。

II. 材料/设备

用于器官型切片的玻璃底培养皿的准备

• 小型注射器（1 mL）
• 23 号针头
• Nucleopore Track-Etch 膜 - 直径 25 mm，孔径 8.0 μm - Whatman，货号 # 110614
• 玻璃底培养皿 - 35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 1.5 盖玻片 - MatTech，货号 # P35G-1.5-14-C
• 橡胶胶水 - Elmer's，货号 # E904
• 基础伊格尔培养基（Basal Medium Eagle）- Gibco，货号 # 21010
• 1 M Hepes（pH 7.4）
• 1 M D-葡萄糖
• 100 mM CaCl₂
• 100 mM MgSO₄
• 1 M NaHCO₃
• dH₂O
• 200 mM L-谷氨酰胺
• 青霉素-链霉素

脑组织提取与包埋

• 麻醉剂（异氟烷等）
• 微波炉
• 低熔点琼脂糖 - Fisher，货号# BP1360-100
• Krazy 胶水 - 货号#KG585
• 一次性 Peel-A-Way 包埋模具（R-40）- 22 mm × 40 mm 矩形，深 20 mm - Polysciences，货号# 18646C

脑切片与RMS移植

• 振动切片机 - Leica VT1000S 及切片制备所需的所有附件组件
• 10 倍汉克平衡盐溶液 - Gibco，货号# 14185
• 显微解剖镊子 #5 - Roboz，货号# RS-4976
• 微型刮匙 - Fisher，货号# 21-401-15
• 体视显微镜

类器官切片的延时成像

• 加湿培养箱，5% CO₂
• 配备培养箱室和长工作距离物镜（数值孔径 NA ≥ 0.6）的倒置显微镜

III. 实验方案

用于组织解剖和切片制备的缓冲液（组织制备缓冲液）

储存液	体积	终浓度
10X HBSS	50 mL	1X
1M Hepes (pH 7.4)	1.25 mL	2.5mM
1M D-葡萄糖	15 mL	30mM
1M CaCl2	0.5 mL	1mM
1M MgSO4	0.5 mL	1mM
1M NaHCO3	2 mL	4mM
dH2O	430.75 mL

使用0.2 μm滤器过滤除菌，并在4°C下保存。

用于器官型切片、组织移植和成像的培养基（切片培养基）

储存液	体积	终浓度
巴斯德基础培养基	35 mL
组织制备缓冲液	12.9 mL
1M D-葡萄糖	1.35 mL	20mM
200mM L-谷氨酰胺	0.25 mL	1mM
青霉素-链霉素	0.5 mL	100单位/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素

使用 0.2 μm 滤器过滤除菌，并在 4°C 下保存。

低熔点琼脂糖凝胶的制备

将低熔点琼脂糖按 0.3 g/mL 的比例溶解于组织制备缓冲液中，置于 50 mL 锥形管中（参见配方）。将锥形管以高功率微波加热，每次加热 5–10 秒，分次进行。加热次数取决于总体积；对于 10 mL 溶液，通常进行三次加热（分别为 10 秒、8 秒和 5 秒）即可。每次加热间隔需小心拧开管盖，以释放管内气压，防止管子爆炸。操作时需格外小心，因为管内物质温度极高。待琼脂糖完全溶解后，将锥形管置于 37°C 水浴中至少 5 分钟，使温度稳定后再使用。长时间暴露于室温会导致凝胶硬化。尽管应尽可能避免凝胶硬化，但在初次制备后的 24 小时内，已硬化的凝胶可重新加热熔化并立即使用。

类器官切片免疫组织化学

在共聚焦显微镜成像后，切片可在含4%多聚甲醛的PBS中于4°C固定过夜。随后将切片在含10%山羊血清和1% Triton X（Sigma，货号：S26-36-23）的PBS中于4°C封闭过夜，接着于4°C与一抗孵育过夜。使用荧光标记的山羊来源二抗进行检测（所有抗体均按1:1000稀释，室温孵育1小时）。标记后的切片在封片前需用冰冻PBS彻底洗涤5–6次，然后置于载玻片上并加盖盖玻片。

四、代表性结果

近年来，我们的器官型脑片培养方案经过充分测试和优化，可确保细胞迁移模式和方向的一致性。对来自在Nestin启动子驱动下诱导表达红色荧光蛋白Td-tomato（Nestin-Td tomato）小鼠的外植体中迁移出的细胞进行分析，结果显示tdTomato+神经母细胞向宿主喙侧迁移流（RMS）的迁移具有高度定向性和快速性（图4A）。高倍时间推移成像分析显示，在20分钟的成像过程中，迁移中的神经母细胞全长可被清晰分辨（图4B）。

含有供体Td-tomato+细胞的脑片经过固定，并对纹状体迁移束（RMS）内的不同细胞组分进行免疫染色。通过荧光免疫组织化学方法显示了GFAP+星形胶质细胞和CD31+血管（图5A）。对细胞骨架蛋白肌动蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）染色的脑片进行高倍镜分析，揭示了处于迁移过程中的细胞对这些组分的表达呈不均匀分布（图5B）。

本示例中使用的抗体：兔抗 RFP（Abcam，1:250）、兔抗 GFAP（Dako，1:1000）、大鼠抗 CD31（BD Pharmigen，1:100）、小鼠抗肌动蛋白（Santa Cruz，1:500）、兔抗微管蛋白（Sigma，1:1000）、驴抗小鼠 Cy3（Chemicon，1:1000）、驴抗兔 AlexaFluor 647（Invitrogen，1:1000）、驴抗大鼠 AlexaFluor 488（Invitrogen，1:1000）、驴抗兔 AlexaFluor 488（Invitrogen，1:1000）。

图 1. 器官型脑片用玻璃底培养皿的制备。 在培养皿的圆形玻璃底面（红色）周围放置多个胶点，留出一侧开口，以便从滤膜下方更换培养基。在玻璃盖玻片中央加入 150μL 的脑片培养基。然后将核孔膜（蓝色）有光泽的一面朝下贴附，确保玻璃盖玻片与膜之间无气泡残留。在膜上方加入 1 mL 脑片培养基（灰色），并将培养皿在使用前于 37°C 条件下孵育。

图 2. 脑组织的取出及切片前准备。(A) 通过从颈部至吻部切开头皮（沿中线的虚线）暴露颅骨。然后从枕大池开始，沿纵向和前向对颅骨进行切割，包括1条中线切口和2条侧向切口（每侧各1条；2A）。(B) 切除大脑皮层最外侧部分以及中枢神经系统（CNS）的尾端部分，以提高振动切片过程中组织的稳定性。(C-D) 随后将两个半脑分离，并以内侧面朝下放置于包埋模具中，随后加入溶于组织制备缓冲液中的3%琼脂糖凝胶。

图3. 脑切片与交叉移植。（A） 将宿主组织切成150 μm厚的切片，并将含有RMS的切片小心地平铺在低温玻璃底培养皿的核孔膜上。（B） 对供体脑（RMS中表达荧光报告基因的脑组织）进行250 μm厚的切片，并将切片收集至冰上预冷的组织制备缓冲液中。显微解剖分离供体RMS，并将其切割成小块组织块。使用配备20 μL吸头的移液器，将单个RMS组织块转移至宿主RMS的切口部位。（C） 经过1–2小时孵育后，将培养皿转移至共聚焦显微镜的恒温载物台上，通过延时成像记录细胞迁移过程。该显微照片为典型脑切片（灰色）在移植后1小时的代表性低倍图像（红色组织块来自表达tdTomato的供体小鼠RMS；红色虚线标示宿主切片中RMS的范围）。

图4. 神经母细胞从外植体迁移进入宿主脑室下区-嗅球通路（RMS）。(A) 移植后1小时，Nestin-tdTomato+神经母细胞（红色）从外植体迁移进入宿主RMS（绿色虚线）。侵入宿主组织切片RMS区域的tdTomato+细胞以高度定向且快速的方式，从侧脑室区（SEZ）向嗅球（OB）方向迁移。(B) 在约20分钟的时间内，可通过高倍时差成像观察单个神经母细胞的迁移周期。比例尺 = 10 μm。

图5. 器官型脑片的免疫组织化学评估。 移植后12小时，在迁移过程中固定移植的神经母细胞（红色）。(A) 脑片的荧光免疫组织化学染色显示，在宿主脑片的吻侧迁移流（RMS）内存在大量GFAP阳性星形胶质细胞（蓝色）以及散在分布的CD31阳性血管（绿色）。(B) 通过使用抗肌动蛋白（蓝色）和抗微管蛋白（绿色）抗体进行共免疫染色，揭示了宿主RMS中一个孤立的tdTomato阳性迁移细胞（红色）的细胞骨架结构。

讨论

在嗅球中，神经元沿纹状体-嗅球束（RMS）迁移是出生后神经发生的关键组成部分¹。RMS中的迁移沿脑表面切线方向进行。切向迁移的成神经细胞与放射状迁移细胞不同，其差异体现在前体细胞来源的位置以及最终神经元产物的命运上^1,2,3。出生后RMS中相对纯净的切向迁移细胞群体，使这一解剖学上明确的区域成为研究切向迁移机制的理想平台。解析神经元迁移的细胞与分子机制，对于理解多种神经发育性疾病至关重要（例如，参考文献⁴）。这些知识还可能有助于揭示脑肿瘤形成与扩散背后的机制（例如，参考文献⁵），并在未来的神经元替代治疗策略中，为引导重编程的成神经细胞定向迁移至损伤或神经退行性病变部位提供必要基础。

尽管近年来取得了巨大进展，但目前对神经元迁移背后的遗传和分子机制及其与特定亚细胞事件关联的理解仍然支离破碎。在这一研究领域中取得突破的主要困难在于，大多数迁移研究依赖于组织固定和免疫组织化学技术，这些技术被用于间接推断胚胎脑中纹状体迁移路径（RMS）及其他迁移流中细胞迁移的机制。这种“固定”方法并不理想，因为它...