昆虫的嗅觉系统为记录气味物质诱导的反应提供了独特的机会，这些反应形式包括触角电位图（EAG）和单个嗅觉毛记录（SSR），它们分别来自位于触角上所有气味受体神经元（ORNs）的总和反应以及来自单个嗅觉毛内神经元的反应。
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摘要
摘要
昆虫的嗅觉系统为记录气味物质诱导的反应提供了独特的机会，这些反应可表现为触角电位图（EAG）和单个嗅觉毛记录（SSR），分别代表位于触角上所有气味受体神经元（ORNs）的总和反应以及单个嗅觉毛内所含神经元的反应。这些方法已被广泛应用于深入理解昆虫化学通讯机制。所鉴定出的刺激物随后可在害虫管理策略中用作引诱剂或驱避剂。
方案
1. 昆虫
- 实验室中的脐橙螟（Amyelois transitella (Walker)（鳞翅目：麦蛾科）种群源自美国加利福尼亚州弗雷斯诺市杏仁树上采集的成虫。昆虫种群在环境培养箱（Percival Inc, IA）中维持培养，条件为28 ± 2°C、相对湿度75 ± 10%，光照周期为16小时光照:8小时黑暗。
- 每日收集新羽化的成虫，进行性别鉴定后转移至塑料盒（669 mL 午餐盒，13 x 13 cm，高4.5 cm，Rubbermaid）中，盒内放置最多10层吸水纸巾（Thirsty Ultra Absorbent，27.9 x 27.9 cm；Safeway），盒盖打孔以保证空气流通。此设置可提供约100%的相对湿度。
- 进行电生理测量时，使用羽化后2–4天的成虫，并在高湿度条件下保存。
2. 电生理学准备
- 将蛾类（雄性或雌性）轻轻推入一个移液器吸头（200 μL，USA Scientific Inc）中，该吸头从顶部被剪开，使其尖端直径较大（约 2 mm）。用湿润的纸巾残段从另一端轻轻推动蛾体，直至触角和部分头部从吸头尖端伸出。
- 用不干性黏土（Claytoon，Van Aken International，CA）覆盖头部以固定暴露的头部区域，仅留出单眼的一小部分和两条触角暴露。将此准备好的样本置于EAG显微操作仪MP-12（Syntech，德国）平台上的两个电极支架之间。
- 我们使用含丝的1.0 mm硼硅酸盐毛细管（WPI Inc，FL）在P-97型微电极拉制仪（Sutter Instruments，CA）上拉制而成的玻璃电极，获得尖端直径小于1微米的微电极。电极通过反向填充感器淋巴任氏液（Kaissling和Thorson 1980）。在显微镜（Leica MZ75）下，将一根电极插入暴露的眼部区域作为参考电极，而记录电极则容纳两条触角。为便于接触，在插入记录电极前需剪除远端1-2个触角节段。对于单个感器的记录，我们对此装置稍作修改：在显微镜（Olympus BX51WI；800倍放大）下将记录电极刺入感器。通过将玻璃电极插入感器基部来记录动作电位。信号由高阻抗前置放大器（Syntech，德国）放大后，输入UB-IDAC，再通过AUTOSPIKE软件（Syntech，德国）进行离线分析。交流信号经100–10,000 Hz带通滤波，动作电位通过AUTOSPIKE算法由计算机提取，该算法根据峰-谷振幅将信号与噪声区分开。单个神经元的反应以动作电位频率（每秒脉冲数）相对于自发频率的增加（或减少）来计算。
3. 化学刺激物与刺激方案
- 使用最高纯度的化学试剂。来自脐橙螟虫雌性信息素混合物的主要成分 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛购自康涅狄格州的Bedoukian Research Inc公司。化学物质以玻璃蒸馏的正己烷按重量/体积（w/v）稀释，配制成10 μg/μL的储备液，并进一步进行十倍系列稀释。取10 μL溶于正己烷中的刺激物溶液，滴加至一张Whatman滤纸条（8×40 mm）上，在通风橱中轻轻振荡10秒以挥发溶剂，随后将滤纸条放入一支5 mL聚丙烯注射器（BD Syringes, NJ）中，从中可喷出不同体积的刺激物。单独使用正己烷及空注射器作为对照。
- 实验准备置于由Syntech刺激控制器（CS-55型号；Syntech, 德国）提供的加湿气流中，主气流流速为20 mL/sec，叠加一个4 mL/sec、持续500 ms的刺激脉冲。记录信号共10秒，从刺激脉冲开始前2秒起始。在500 ms的刺激过程中，将含有刺激物的5 mL聚丙烯注射器中的约2 mL净化空气注入主气流以刺激触角准备。在产生较强反应后，两次刺激之间至少间隔1分钟或更长时间。
4. 代表性结果
用雌性信息素组分 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛刺激固定后的蛾类触角（图1），可产生显著的剂量依赖性反应（图2）。该主要信息素组分也能从长毛形感器中诱发出剂量依赖性的兴奋反应（图3A），单神经元记录轨迹图中清晰显示了这一现象（图3B）。
图 1. 被固定且触角暴露的活体脐橙螟蛾
图 2. 对 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛（一种主要的雌性信息素组分）引发的剂量依赖性 EAG 反应。
图3. 雄性脐橙螟蛾的毛形感器以剂量依赖的方式响应(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛。(A) 雄性脐橙螟蛾的触角为多节结构，每一节均密布大量毛发状结构，即感器。扫描电子显微照片显示了插图中的细节（比例尺分别为200和50 μM）。(B) 来自毛形感器的细胞外单神经元记录。
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讨论
这种用于固定活体脐橙螟蛾以测量嗅觉信号的新方法已被证明具有高度的稳健性和可靠性。我们常规采用该方法从杏仁和开心果等天然寄主基质中分离并鉴定新型引诱物质。
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致谢
由美国农业部-国家食品与农业研究所（USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582）、美国国家科学基金会（NSF 0918177）和贝杜基安研究公司（Bedoukian Research Incorporation）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微镜 | Olympus Corporation | BX51WI 型号 | |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm 带纤维的硼硅酸盐毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 刺激控制器 | Syntech | CS-55 型号 | |
| 高阻抗前置放大器（通用单端探针） | Syntech | ||
| 放大器/数据采集系统（USB-IDAC） | Syntech | ||
| EAG 显微操作器 MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛 | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman 滤纸 | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL 聚丙烯注射器 | BD Biosciences | 309633 | |
| 移液器吸头（200 μL） | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL 便当盒，13 × 13 cm；高 4.5 cm | Rubbermaid | ||
| Thirsty 超吸水垫，27.9 × 27.9 cm | Safeway | ||
| 不干型黏土 | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| 环境控制室 | I-30BLL 型号 |
参考文献
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
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