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1. 昆虫
- 本实验室的棉铃实夜蛾（Amyelois transitella (Walker) (鳞翅目：螟蛾科)）种群源自美国加利福尼亚州弗雷斯诺市杏仁树上采集的成虫。该昆虫种群在环境培养箱（Percival Inc, IA）中维持培养，条件为28 ± 2°C、相对湿度75 ± 10%，光照周期为16:8小时（光:暗）。
- 每日收集新羽化的成虫，按性别分离后转移至塑料盒（669 mL 午餐盒，13 x 13 cm；高4.5 cm，Rubbermaid）中，盒内放置最多10层浸湿的纸巾（Thirsty 超强吸水性纸巾，27.9 x 27.9 cm；Safeway）。盒盖打孔以保证空气流通。此设置可提供约100%的相对湿度。
- 用于电生理记录的成虫为羽化后2–4天的个体，实验前始终保持在高湿度环境中饲养。
2. 电生理学准备
- 将蛾类（雄性或雌性）轻轻推入一个移液器吸头（200 μL，USA Scientific Inc）中，该吸头从顶部被剪开，使其尖端直径较大（约 2 mm）。用湿润的纸巾残段从另一端轻轻推动蛾体，直至触角和部分头部从吸头尖端伸出。
- 用不干性黏土（Claytoon，Van Aken International，CA）覆盖头部以固定暴露的头部区域，仅留出单眼的一小部分和两条触角暴露在外。将此制备样品置于EAG显微操作仪MP-12（Syntech，德国）平台上的两个电极支架之间。
- 我们使用含丝的1.0 mm硼硅酸盐毛细管（WPI Inc，FL）在P-97型微电极拉制仪（Sutter Instruments，CA）上拉制而成的玻璃电极，获得尖端直径小于1微米的微电极。电极通过后向填充感器淋巴任氏液（Kaissling和Thorson 1980）。在显微镜（Leica MZ75）下，将一根电极插入暴露的眼部区域作为参考电极，而记录电极则容纳两条触角。为便于接触，在将触角插入记录电极前，先剪除远端1–2个触角节段。对于单个感器的记录，我们对此装置稍作修改：在显微镜（Olympus BX51WI；800倍放大）下将记录电极刺入感器。通过将玻璃电极插入感器基部来记录动作电位。信号由高阻抗前置放大器（Syntech，德国）放大后，输入UB-IDAC，再通过AUTOSPIKE软件（Syntech，德国）进行离线分析。交流信号经100–10,000 Hz带通滤波，动作电位通过AUTOSPIKE算法由计算机提取，该算法根据峰-谷振幅将信号与噪声区分开。单个神经元的反应以动作电位频率（每秒峰数）相对于自发频率的增加（或减少）来计算。
3. 化学刺激物与刺激方案
- 使用最高纯度的化学试剂。来自脐橙螟蛾雌性信息素混合物的主要成分，(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛，购自康涅狄格州的贝杜克研究公司（Bedoukian Research Inc）。化学物质以玻璃蒸馏的正己烷按重量/体积（w/v）稀释，配制成10 μg/μL的储备液，并进一步制备十倍系列稀释液。取10 μL溶于正己烷的刺激物溶液，滴加至一张Whatman滤纸条（8×40 mm）上，在通风橱中轻轻振荡10秒以挥发溶剂，随后将滤纸条放入一支5 mL聚丙烯注射器（BD Syringes，新泽西州）中，用于释放不同体积的刺激物。单独使用正己烷以及空注射器作为对照。
- 实验准备在Syntech刺激控制器（CS-55型号；Syntech，德国）提供的加湿气流中进行，主气流速度为20 mL/sec，叠加一个4 mL/sec、持续500 ms的刺激脉冲。记录信号共10秒，从刺激脉冲开始前2秒起始。在500 ms的刺激过程中，将含有刺激物的5 mL聚丙烯注射器中的约2 mL净化空气注入主气流以刺激触角准备。在强反应之后，每次刺激之间至少间隔1分钟或更长时间。
4. 代表性结果
用雌性信息素组分 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛刺激固定后的蛾类触角（图1），可产生显著的剂量依赖性反应（图2）。这种主要信息素组分也能从长毛形感器中引发剂量依赖性的兴奋反应（图3A），单神经元记录轨迹图中显示了该反应（图3B）。
图1. 活体脐橙螟蛾被固定且触角暴露
图2. 雌性信息素主要组分 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛诱导产生的剂量依赖性EAG反应。
图3. 雄性脐橙螟蛾的毛形感器以剂量依赖的方式对(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛产生反应。(A) 雄性脐橙螟蛾的触角为多节结构，每一节均密布大量毛发状结构，即感器。扫描电子显微照片显示了插图中的细节（比例尺分别为200和50 μm）。(B) 毛形感器的胞外单神经元记录。