在本实验方案中，我们介绍了一种在96孔微孔板中测定Caenorhabditis elegans寿命的方法。
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摘要
摘要
寿命是由多个遗传通路调控的生物学过程。研究衰老生物学的一种策略是分析那些在年龄调控通路组分中携带突变的动物。如果这些突变干扰了年龄调控通路的功能，从而改变整个生物体的寿命，则可提供重要的机制性见解1-3。
研究寿命调控的另一种策略是利用小分子干扰年龄调控通路。迄今为止，已发现多种分子可在不同模式生物中延长寿命，并被用作研究衰老生物学的工具4-16。然而，与可用于研究衰老生物学的遗传“工具集”相比，目前鉴定出的分子数量仍然较少。
Caenorhabditis elegans 由于其优良的遗传背景和约三周的短寿命，是研究衰老的主要模式生物之一。近年来，由于其体型微小且能够在微孔板中培养，C.elegans 也逐渐成为基于表型进行药物筛选的模式生物5,7,16-20。
在此，我们介绍一种用于测量的实验方法 秀丽隐杆线虫 在96孔微孔板中测定寿命。该检测方法已被开发并成功用于筛选可延长寿命的分子大型文库 秀丽隐杆线虫 寿命7通过多项测试评估了该检测方法的可靠性：首先，测量在不同温度下培养的野生型动物的寿命；其次，测量寿命发生改变的突变体动物的寿命；第三，测量不同浓度抗抑郁药物米氮平处理下寿命的变化。已有研究表明，米氮平可延长寿命 秀丽隐杆线虫7这些测试结果表明，该检测方法能够重复其他检测方法 previously 获得的结果，并具有定量能力。微孔板格式还使该寿命检测与自动化液体处理系统兼容，可整合到自动化平台中。
方案
概述：本实验方案分为四个部分。第1部分介绍如何制备喂养用细菌。第2部分介绍如何制备线虫培养物。第3部分介绍如何进行寿命评分。第4部分展示一些代表性结果，第5部分介绍如何制备所需溶液。寿命实验需要数周才能完成。方案中的每个步骤均包含周数、日期及具体时间，以便于实验规划。整个方案以L4期（第0天）作为参考时间点。
1. 喂养细菌的制备
本部分介绍饲喂细菌的制备方法。用于饲喂C. elegans的特定E. coli菌株称为OP50。在本方案实施前，为防止线虫培养物被其他细菌交叉污染，OP50菌株已被改造为具有羧苄青霉素/氨苄青霉素抗性21。OP50需提前4至5天制备。所有与OP50接触的材料必须保持无菌。
第 -7 天：周四（第1周）：取5 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素和0.1 μg/mL两性霉素B的TB培养基，接种一个OP50单菌落，于37°C细菌摇床中过夜培养。
第 -6 天： 星期五（第 1 周）。
上午8:30。尽早接种，以保证培养物有足够时间达到饱和状态
- 将OP50过夜培养物按1:2000比例稀释于300 mL含有50 μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中。在37°C条件下，于细菌摇床中培养8–12小时，直至达到饱和状态。培养时间不得超过14小时。
- 将OP50转移至一个无菌且预先称重的离心管中。使用台式离心机以3500 rpm（2200 ×g）离心10分钟，沉淀OP50。
- 弃去上清液，用无菌水重悬OP50沉淀，并再次离心收集沉淀。重复此洗涤步骤两次。
- 第二次洗涤后，小心移除所有残留水分，确保离心管内无任何水分残留。称量含有沉淀的离心管重量，并减去空离心管的重量，以确定沉淀物的净重。
- 将沉淀物充分重悬于S-complete培养基中，使其浓度达到100 mg/mL，确保无任何团块残留。
- 100 mg/mL OP50的浓度应相当于2×1010个细菌/mL。若已知光密度与每毫升细菌数量之间的关系，可使用分光光度计测定每毫升的细菌数。如有必要，将OP50饲喂液的浓度调整至2×1010个细菌/mL。
- 将OP50溶液储存于4°C，待用于线虫培养时使用。
2. 同步线虫培养物的制备
本部分描述了线虫培养物的制备。其目标是获得年龄同步的线虫群体。在第5步漂白处理后，所有与C.elegans接触的材料必须保持无菌。除非另有说明，培养板置于20°C下保存。
第 -6 天： 第一周，星期五，下午 4:00：将动物转移至新的培养皿
- 取一个培养 5 至 10 天的 NGM 平板，其上的线虫群体主要由饥饿状态的 L1 幼虫组成。
- 将金属刮铲在本生灯火焰上短暂加热以灭菌，待其冷却后，用冷却的刮铲从平板上切取含有饥饿线虫的琼脂块。将数块琼脂转移至新制的、接种了 OP50 的 10 cm NGM 平板上。在 20 °C 下培养约 65 小时，直至线虫群体主要发育为产卵期成虫。饥饿 L1 阶段线虫发育至产卵期成虫所需时间可能因品系不同而有所差异。
第 -3 天： 第二周星期一 上午10:00：建立同步化细胞群体
- 用 5–10 mL 无菌水从 10 cm 培养皿中冲洗收集线虫，将线虫与水的混合液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
- 在台式离心机中以 1200 rpm（280 × g）离心 2 分钟，洗涤线虫。弃去上清液，加入 10 mL 水，重复一次。
- 弃去上清液，加入 5 mL 新鲜配制的次氯酸钠/氢氧化钠溶液（2.5 mL 家用漂白剂，1 mL 10N NaOH，6.5 mL H2O）。室温孵育 5 分钟，直至线虫裂解。每隔 1 分钟轻柔涡旋混匀一次。在解剖显微镜下监测反应进程。
- 一旦所有成虫完全溶解，立即加入 5 mL M9 缓冲液以中和反应。
- 用 10 mL M9 缓冲液洗涤卵三次，每次以 2500 rpm（1100 × g）离心 2 分钟。
- 用 10 mL S-complete 培养基洗涤卵一次，以 2500 rpm（1100 × g）离心 2 分钟。
- 弃去上清液，加入 10 mL S-complete 培养基，将悬液转移至一个新的 50 mL 圆锥形离心管中，再加入 30 mL S-complete 培养基，终体积为 40 mL。在室温下，使用旋转混合仪或类似装置轻轻振荡过夜。
第 -2 天： 第二周，星期二，中午 12:00：将动物接种至培养板中
- 在解剖显微镜下检查线虫是否在夜间孵化。使用解剖显微镜计数10 μL液滴中的线虫数量，以确定S-complete溶液中线虫的浓度。每份样品至少计数10个液滴。
- 将线虫重新悬浮于S-complete溶液中，浓度为80–100条线虫/mL。加入羧苄青霉素（储存液100 mg/mL）至终浓度50 μg/mL，并加入两性霉素B（储存液250 μg/mL）至终浓度0.1 μg/mL。置于旋转混合仪上震荡。若需制备较大量线虫，可使用带滤膜盖的600 mL Nunclon培养瓶。
- 下午2:30，将第1部分制备的OP50菌液加入至终浓度6 mg/mL（= 1.2 × 109 细菌/mL）。将剩余OP50菌液放回4°C保存。
- 将120 μL线虫/OP50混合液转移至96孔板的每个孔中。使用底部透明的96孔板。移液过程中需确保线虫保持悬浮状态。
- 用封板膜密封培养板，防止污染和蒸发。将培养板置于微孔板振荡器上震荡2分钟，随后在20°C下培养2天，直至线虫发育至L4期。
第0天： 第2周的星期四中午前：通过添加氟脱氧尿苷（FUDR）对动物进行灭菌处理
- 为动物进行灭菌处理，向每孔加入 30 μL 的 0.6 mM FUDR 储存液。此步骤使每孔的终体积达到 150 μL，并将 OP50 的终浓度从 6 mg/mL 降低至 5 mg/mL（即 1×109 个细菌/mL）。使用封板膜密封培养板，并在微孔板振荡器上振荡 2–3 分钟。若在第 -2 天 2:30 添加了 OP50，则必须在中午之前完成 FUDR 的添加。将培养板放回 20°C 培养箱中继续培养
第1天： 第2周星期五：向培养物中添加药物
- 到上午9:00时，大多数动物应已处于产卵期，每只含有数枚卵。加入待测药物至所需浓度。若使用DMSO溶解药物，DMSO的终浓度不应超过0.6%，因为高于0.6%的DMSO浓度会缩短C.elegans的寿命。加药后，用封板膜密封培养板，并在微孔板振荡器上振荡2-3分钟。将培养板放回20°C培养箱中
- 加药过程偶尔会导致每板少量动物死亡，尤其是使用非水溶剂时。使用倒置显微镜检查死亡个体。通常情况下，每块96孔板死亡动物应少于10只。将培养板放回20°C培养箱中
第4天：周一（第3周）：更换封闭剂
- 为使新鲜氧气进入培养物，打开封口膜，等待1分钟，然后重新密封培养板。将培养板在微量滴定板摇床中振荡2-3分钟。每周重复一次。
第5天： 第3周星期二：添加新的OP50以防止饥饿
- 向每个96孔板的孔中加入5 μL第1部分制备的100 mg/mL OP50溶液，以防止线虫饥饿。
3. 寿命评分。
本部分描述了如何监测第2部分中同步化线虫群体的存活情况，直至动物死亡。观察96孔板中的动物时，使用配备2倍或2.5倍物镜的倒置显微镜。每周记录三次存活数据，分别为周一、周三和周五。通过运动情况判断动物是否存活。强光（尤其是蓝光）可诱导动物产生运动。不要从检测体系中移除已死亡的动物。偶尔会出现某些动物在前一次计数时未移动并被判定为死亡，但在后续观察中又出现运动的情况。
- 在第0天实验开始时，统计每个孔中的线虫总数。若某孔中线虫数量超过18只，则在分析中剔除该孔，因为这些孔中的线虫将无法获得足够的OP50，从而表现出饮食限制效应。
- 为提高线虫活动的概率，在计数前将96孔板置于微量板摇床上振荡2分钟。
- 每次计数时，记录日期以及能够活动的线虫数量，将其记为存活个体。线虫在液体中的运动比在固体培养基上更容易观察，且可通过强光刺激诱导。使用更高倍率的显微镜有助于观察极其微弱的运动，例如咽部末端的轻微活动。此类微弱运动往往是高龄线虫中唯一可见的活动迹象。
- 将培养板放回20°C恒温培养箱中继续培养。
- 每两到三天重复步骤2至4，直至所有线虫死亡。
4. 代表性结果。
本部分展示了如何记录该检测生成的寿命数据以及一些代表性结果的示例。
图1A展示了在此实验中如何记录寿命数据的示例。使用Excel表格记录每孔中种群的存活情况。在实验开始时，需记录每孔在培养板中的坐标、菌株、药物、药物浓度以及第0天存活动物的总数（X0）。每周三次记录日期以及存活和死亡动物的数量，以追踪各孔中不同种群的存活情况。为绘制结果图，需计算每天存活动物的比例，并将其对时间（以天为单位）作图。P值应使用STATA等统计软件包进行计算。
C.elegans 的平均寿命具有温度依赖性。图 1B 显示，基于微量滴定板的寿命测定法能够准确重现寿命的温度依赖性变化22。同样，微量滴定板法也能重现突变体寿命的变化，这些突变体的寿命已被报道与野生型 N2 动物不同23-24 25（图 1C）。
该检测还可用于进行更定量的分析。在图1D中，平均寿命被绘制为米氮平浓度的函数7。每个数据点代表7-12个群体的平均寿命，每个群体生活在不同的孔中。尽管每孔动物数量相对较少（5-15只），但从误差线可以看出，孔与孔之间的变异相对较小。
图 1. 基于微孔板的寿命测定实验能够准确重现文献中报道的寿命变化。
（A）在 Excel 电子表格中收集的示例数据。每次计数时，记录日期、孔位坐标以及存活和死亡个体的数量。实验开始时，确定每个孔中的动物总数。（B）野生型（N2）动物在 20°C 和 25°C 条件下培养的生存曲线。（C）携带影响寿命突变的品系的生存曲线。所有四个品系均在 20°C 下平行测定。（D）经米氮平处理的 N2 动物的剂量反应曲线。平均寿命随米氮平浓度的变化而变化。误差条表示每种条件下 8 个孔的标准误（S.E.M）。
5. 材料。
M9 缓冲液，1000 mL
- 6 g Na2HPO4
- 3 g KH2PO4
- 5 g NaCl
- 0.25 g MgSO4∙7H2O
- 加去离子水至 1000 mL
- 高压灭菌
磷酸钾缓冲液 pH 6.0，1000 mL
- 136 g KH2PO4
- 加入去离子水至 900 mL
- 用 5M KOH 调节 pH 至 6.0
- 加入去离子水至 1000 mL
- 高压灭菌
痕量金属溶液
- 1.86 g Na2EDTA
- 0.69 g FeSO4 ∙7H2O
- 0.20 g MnCl2 ∙ 4H2O
- 0.29 g ZnSO4 ∙7H2O
- 0.016 g CuSO4
- 1000 mL 去离子水
- 高压灭菌，并避光保存。
S-基础培养基，1000 mL
- 5.9 g NaCl
- 50 mL 1M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0
- 1000 mL 去离子水
- 高压灭菌
- 待溶液冷却后，加入 1 mL 5 mg/mL 胆固醇（溶于乙醇）。
1 M 枸橼酸钾，1000 mL
- 268.8 g 三水合柠檬酸钾
- 26.3 g 一水合柠檬酸
- 加入 900 mL 去离子水
- 用 5M KOH 将 pH 值调节至 6.0
- 用去离子水定容至 1000 mL
- 高压灭菌
S-完全培养基，1000 mL
- 977 mL S-基础培养液
- 10 mL 1 M 柠檬酸钾，pH 6（无菌）
- 10 mL 微量金属溶液（无菌）
- 3 mL 1 M CaCl2（无菌）
- 3 mL 1 M MgSO4（无菌）
NGM 琼脂
- 3.0 g NaCl
- 2.5 g 蛋白胨（来自酪蛋白，胰消化物）
- 17 g 琼脂
- 加入去离子水至 975 mL，并放入搅拌子
- 高压灭菌
- 灭菌后冷却至 55°C，然后加入以下组分：
- 0.5 mL 1 M CaCl2（无菌）
- 1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液
- 1 mL 1 M MgSO4（无菌）
- 25 mL 磷酸钾缓冲液，pH 6.0（无菌）
TB，1000 mL
- 12 g Bacto 胰蛋白胨
- 24 g 酵母提取物
- 4 mL 甘油
- 加入 900 mL 去离子水
- 高压灭菌
- 灭菌后冷却至 55°C，然后加入以下组分：
- 加入 100 mL 0.17 M KH2PO4/0.72 M K2HPO4
0.6 mM 氟脱氧尿苷（FUDR，sigma 目录号# F0503），1000 mL
- 100 mg FUDR
- 溶于 670 mL 无菌 S-complete 培养基中，分装为 10 mL 或 45 mL 等份。
- 置于 -20 °C 保存。
100 mg/mL 羧苄青霉素，10 mL
- 1 g 羧苄青霉素
- 10 mL 无菌去离子水
- 无菌过滤并分装
- 在 -20 °C 下保存
- 使用时终浓度为 50 μg/mL
250 µg/mL 两性霉素 B，4 mL
- 1 mg 两性霉素 B
- 4 mL 乙醇
- 于 -20 °C 保存
- 使用时终浓度为 0.1 μg / mL
讨论
本方案介绍了在96孔微孔板中测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命的方法。如代表性结果部分所示，该方法能够可靠地重复先前的研究结果，并提供定量信息。利用此检测方法，我们已成功筛选了超过89,000种分子对秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命的影响。
在药物筛选中，采用96孔微孔板形式测定寿命相较于传统的固体培养基检测具有多项优势。该方法减少了培养基制备所需的人力、孵育空间以及药物用量。96孔板格式与显微镜装置相结合，可实现整个检测过程的自动化，适用于高通量筛选。
在建立该检测方法的过程中，对每个变量及其组合的多个取值进行了测试，以评估其对秀丽隐杆线虫（C.elegans）寿命的影响。测试内容包括：OP50浓度在3至10 mg/mL范围内的不同梯度（3、4、6、8、10 mg/mL），每孔线虫数量在7至45条之间的不同设置（7、10、15、22、45 条/孔），培养体积在40至150 μL/孔之间的不同条件（40、60、80、100、120、150 μL），以及缓冲液成分的调整。当使用耐羧苄西林的OP50菌株时，实验表明，在所指示的浓度下，羧苄西林或两性霉素B均未影响C.elegans的寿命。通常在C.elegans液体培养中推荐的持续轻柔振荡，在本检测所用的小体积条件下被证明并非必需。然而，若使用孔体积较大的微孔板，则仍需进行轻柔振荡。本方案中所列参数值是基于对不同实验条件进行统计学比较后慎重选定的。
该实验最令人惊讶的特点可能是秀丽隐杆线虫（C.elegans）可以被饲养在用胶带密封的96孔板中。并行比较显示，在未密封的孔板、用塑料封膜密封的孔板，或使用允许气体交换的封膜密封的孔板中培养的线虫，其寿命没有差异。在这三种条件下，线虫从L1期发育至产卵成虫均非常均一，耗时约65小时，且寿命极为相近。与之平行在NGM平板上培养的线虫发育略快，但这一差异与是否使用封膜无关。
本方案基于活细菌，但也可适用于灭活细菌。然而，在液体检测中，单个存活的细菌可迅速增殖并重新占据整个培养体系。据我们经验，唯一能够彻底灭活细菌并使其适用于液体培养的方法是采用伽马射线对细菌进行长时间辐照处理。
在设计寿命实验时，一个需要考虑的重要因素是检测效能。根据效应大小的不同，对目标药物的效果需在多个孔中进行测试。在典型的实验中，设置4个加药组孔和4个对照组孔，每孔大约包含40至50只动物，即可在超过95%的实验中检测到寿命延长30%的效果。而14%的寿命延长仅能在60%的实验中被检测到，因此需要增加重复孔的数量。
本实验方法产生的大量寿命数据可用于建立针对特定实验或菌株的参数化冈珀茨模型1。这些冈珀茨模型有助于确定检测效能，并估算大规模筛选中假阳性与假阴性的数量。我们通过盲法实验验证了这些模型的预测结果，并将其用于估算大规模筛选中假阴性数量（未发表结果）。
总之，我们预计所展示的实验方法将有助于发现能够延长秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命的小分子，并用于研究其潜在的作用机制。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本实验方案最初由西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心Linda Buck实验室的Xiaolan Ye和Michael Petrascheck开发。上述详细版本已进行整理，以便向更广泛的研究群体公开整个实验流程。感谢Carol Taylor、Sarah LeBoeuf和Andy Tomacelli对本方案的审阅与建议。本文为斯克里普斯研究所第2866号手稿。Petrascheck实验室由诺华ADI项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 两性霉素B | Calbiochem | 货号# 171375 | 又称Fungizone |
| FUDR | Sigma-Aldrich | 货号# F0503 | FUDR遇热失活，需在冷水中解冻 |
| 米安色林 | Sigma-Aldrich | M2525-250MG | 用作阳性对照，终浓度为50μM |
| 赛庚啶 | Sigma-Aldrich | 货号#C6022-MG | 替代阳性对照，终浓度为10 μM |
| 封板膜 | Nalge Nunc international | 货号# 236370 | 聚酯材质，非无菌 |
| 96孔板 | Falcon BD | 货号# 351172 | 未经表面处理，透明，独立无菌包装，聚苯乙烯材质 |
| Nunclon培养瓶 | Nalge Nunc international | 货号# 178883 | 用于大体积培养 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 5/18/2011. Citeable Link.
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