用于测量运动功能、学习和记忆能力的行为学实验 果蝇.
本文内容
摘要
摘要
遗传学方法的进步使得利用果蝇（Drosophila）作为模式系统来研究人类神经退行性疾病相关基因成为可能1。大多数此类疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病，均表现为随年龄增长而出现的学习记忆功能和运动协调能力的进行性衰退2。本文中，我们采用行为学检测方法，包括负向趋地性实验3和厌恶光趋向抑制实验（APS实验）4,5，证明与人类神经退行性变相关的一些行为特征可在果蝇中被重现。在负向趋地性实验中，利用果蝇在受到刺激时逆重力方向运动的自然倾向，来研究可能影响其运动能力的基因或条件。在APS实验中，通过训练具有正向趋光性的果蝇将光线与令人厌恶的苦味联系起来，从而使其抑制原本趋向光线的自然行为，以此检测果蝇的学习和记忆功能。在训练后6小时对这些经过训练的果蝇进行测试，可用于评估其记忆功能。利用这些行为学实验，可方便地在果蝇中研究任何遗传或环境因素对神经退行性变发展的贡献。
方案
1. 引言
在本视频中，我们将演示利用果蝇（Drosophila）进行的两种行为学检测方法，用于评估在神经退行性疾病中受损的运动能力以及学习与记忆功能。首先，我们将展示如何通过负向趋地性实验来测量果蝇的运动行为。其次，我们将使用具有正向趋光性的果蝇，通过训练其将光线与厌恶性的苦味刺激相关联，并在6小时后进行测试，以评估其学习与记忆能力。最后，我们将讨论这些行为学检测方法的意义及其局限性。
2. 仪器与试剂
- 果蝇实验
- 体视显微镜（Zeiss）
- 用于推动果蝇的小型画笔
- Drosophila 二氧化碳（CO2）麻醉装置（Geneseesci, Inc）
- 负向趋地性实验
- 28.5 x 95 mm 聚苯乙烯小瓶（Capitol Vial, Inc.）
- 迷你闹钟计时器/秒表（VWR International）
- 记号笔
- 胶带
- 厌恶性趋光抑制实验
- 盐酸奎宁（Sigma Aldrich；CAS编号：6119-47-7）
- 蒸馏水
- 数字电子天平，用于按重量精确稀释
- 快速断开连接器，高密度聚乙烯材质（NALGENE VWR 目录号：62868-021）
- 15 mL 离心管（VWR International），从封闭端起在2 mL刻度处剪断，以便与光源的快速断开连接器适配器配合使用
- 单通道200 μL移液器，用于将奎宁溶液加样至实验腔内的滤纸衬里上
- T型迷宫（Simple Behavioral Systems；图1）
- 铝箔
- 光源（Zeiss）
- 带有红光的灯
- 滤纸
- 迷你闹钟计时器/秒表（VWR International）
3. 准备果蝇
- 果蝇在标准的玉米粉-琼脂-糖蜜-酵母培养基中饲养，饲养条件为25°C，12小时光照/12小时黑暗循环。
- 在羽化当天，使用二氧化碳麻醉法分离处女蝇。进行衰老研究时，将果蝇以每管20只的密度分组饲养，并每隔3天转移至新的培养管中。进行衰老研究时，应使用同一亲本杂交产生的同胞果蝇，以尽量减少遗传背景差异带来的影响。
- 在进行两种实验时，均需按性别分开果蝇，并以每管10只的密度进行分组饲养。性别对行为的影响显著，因此建议在研究中不要混合雄性和雌性果蝇，否则可能导致数据难以解释和重复6。
- 进行负向趋地性实验时，将果蝇按每管10只分组，并在麻醉后1小时进行测试。果蝇必须从麻醉中完全恢复，因为麻醉可能影响其运动活动。
- 进行APS实验前，将每组果蝇放入装有湿润滤纸的空聚苯乙烯管中饥饿处理6小时，以确保果蝇在实验前处于饥饿状态，从而对厌恶味觉更为敏感。实验开始前，将每组中的每只果蝇单独放入一个空的15 mL离心管中，并轻轻盖上盖子，以防逃逸。
4. 负向重力趋性实验
- 通常对十到二十组相同基因型或处理的个体（每组十个个体，每个基因型/处理共100-200只果蝇）进行趋地性测量7。在CO2麻醉装置上将十只雌性或雄性果蝇分组，并将每组放入单独的试剂瓶中。让果蝇至少恢复一小时以从麻醉中苏醒。
- 为每组准备攀爬装置，使两个空的聚苯乙烯试剂瓶通过胶带垂直对接，瓶口相对。必须确保试剂瓶的开口完全对齐，以提供平坦的攀爬表面。
- 对于下方的试剂瓶，从底部表面垂直测量8 cm的距离，并在试剂瓶周围画一个完整的圆圈作为标记。
- 小心地将一组十只果蝇转移至下方试剂瓶中，防止任何果蝇逃逸。立即用上方试剂瓶盖住下方试剂瓶，并在接触口附近用胶带牢固固定。让果蝇适应新环境1分钟后，再开始实验。
- 轻轻敲击试剂瓶，使果蝇全部落到底部，然后在敲击后10秒内记录攀爬至8 cm标记线以上的果蝇数量。
- 对同一组果蝇重复此实验十次，每次试验之间留出1分钟的休息时间。
- 将每组通过8 cm标记线的果蝇数量记录为占总果蝇数的百分比。
5. 厌恶性光趋避抑制实验（APS 实验）
该实验最初改编自 Le Bourg 和 Buecher（2002）4，利用果蝇的正趋光性行为，训练其将光线与厌恶刺激（本实验中为奎宁的苦味）相关联。经过训练/条件化阶段后，野生型果蝇能够将有光区域与厌恶味道关联起来并主动回避。学习能力受损的果蝇则无法建立这种关联。此外，APS 实验还可用于检测果蝇的短期记忆功能5，方法是在条件化处理后6小时，对已完成训练的果蝇再次进行相同测试，以评估其对已学习任务的记忆能力。
- 制备奎宁溶液
- 将盐酸奎宁溶于蒸馏水中，配制成 0.1 M 的储备液（1.98 g 溶于 50 mL 蒸馏水）。储备液可分装后于 -20°C 保存，最长可达一年。
- 用蒸馏水将储备液稀释，配制 1 μM 的工作液。
- 制备 T 型迷宫
- T 型迷宫由中央柱体、一个活门以及两个独立的腔室组成，分别为“暗室”和“亮室”（图 1）。
- 腔室制备：取两个 15 mL 塑料离心管，用手工锯从底部封闭端向上在 2 mL 刻度处锯开。在两端安装连接适配器，并用 Parafilm 封口膜密封接口。管端的适配器用于插入鹅颈式光源。将其中一个管连接光源，作为“亮室”；另一个管用铝箔包裹，作为“暗室”。
- 向滤纸加入 180 μL 蒸馏水或奎宁溶液，并将其放入亮室中。
- 将亮室和暗室分别旋接至中央柱体的两侧，中间活门保持关闭状态（图 1）。
- 将光源插入亮室中。
- 利用厌恶刺激训练果蝇抑制趋光性
- 将暗室从 T 型迷宫上拧下，转移一只果蝇进入该室，然后立即重新拧紧暗室。
- 关闭房间照明，打开红色光源。
- 让果蝇在暗室中适应 30 秒，随后缓慢开启照亮亮室的光源，并缓慢打开分隔两室的活门。
- 如果果蝇在 10 秒内进入亮室，则视为具有正趋光性，可用于后续实验训练。若果蝇未表现出趋光行为，提示其视觉系统可能存在异常，此类果蝇应从实验中剔除。
- 对于厌恶性趋光抑制（APS）训练，轻敲已表现出正趋光性的果蝇，使其返回暗室，关闭活门并关闭光源。让果蝇适应 30 秒，在此期间将含奎宁溶液的滤纸放入亮室。随后缓慢打开活门并开启光源，允许果蝇进入涂有奎宁的亮室。1 分钟后，轻敲果蝇使其返回暗室，并重复此过程共 10 次。（通常，野生型果蝇在经过 3 至 5 次训练后即会避免进入亮室。）
- 训练结束后立即进行 5 次测试试验。每次测试中，开启光源后等待 10 秒，观察训练后的果蝇是否进入亮室。若果蝇未进入亮室，则记录为“通过”，相当于“通过强化学习掌握了任务”。记录连续 5 次试验中的通过率，并在图 2 中表示为 PC0（条件化后 0 小时）。
- 评估果蝇的短期记忆功能
- 完成训练及初始 PC0 记录后，将每只果蝇放回其原始食物管中，在常温下静置 6 小时。
- 训练后 6 小时，对每只果蝇再次进行 5 次与之前相同的测试，记录果蝇避免进入（通过）或进入（失败）亮室的次数。该通过率记为 PC6（条件化后 6 小时），作为短期记忆的指标。
6. 数据解释与统计分析
- 负向重力趋向性实验
- 本实验产生的原始数据表示每组果蝇在10秒内越过8 cm标记的个体数量。将其转换为百分比，并计算每组在10次实验中的平均通过率。
- 数据以图形方式表示，展示各组（基因型、处理方式等）的平均通过率，并标注平均值的标准误（SEM）。
- 随后可采用学生t检验或方差分析（ANOVA）判断组间差异是否具有统计学显著性。
- 厌恶性趋光抑制实验
- 本实验的原始数据表示每只果蝇在连续五次试验中避开光照区域的次数。通过率计算为成功回避试验次数占总试验次数的百分比。每组至少对15只果蝇进行测试，并以此方式计算平均通过率。
- 数据以图形方式表示为PC0平均通过率（训练后立即测试，作为“学习”指标）或PC6平均通过率（训练后6小时测试，作为“记忆”指标），并分别标注相应的标准误（SEM）。
- 应将学习和记忆指数在各组之间进行比较，包括野生型组和“遗传操作但无害”对照组（如过表达GFP的果蝇）。
7. 代表性结果
在本视频实验中，我们评估了在中枢神经系统中过表达人源 Tau 蛋白的果蝇的学习记忆能力及运动功能缺陷，并将其表现与过表达 GFP 的果蝇进行比较。Drosophila 中神经元过表达人源 Tau 蛋白已被证实可导致大脑严重空泡化8，并引起显著的学习与记忆功能障碍9。如图 2A 所示，与同龄对照组过表达 GFP 的果蝇相比，过表达人源 Tau 蛋白的 10 日龄雄性或雌性果蝇表现出显著的运动能力缺陷。此外，这些果蝇无法将光线与苦味建立关联，表现为 PC0 通过率低于对照组；同时，它们也无法维持该关联记忆，表现为 PC6 通过率下降（图 2B）。本实验进一步验证了Drosophila 模型可用于研究人类神经退行性疾病，并可重现人类及哺乳动物中观察到的部分行为表型。
图 1. 厌恶性趋光抑制实验用 T 型迷宫装置。 A. APSA 实验的整体装置示意图，光源连接至“明亮”一侧的 Falcon 管，管内衬有滤纸，左侧为“黑暗”管（用铝箔包裹），两管之间由一道闸门隔开。B. 在训练和测试阶段，果蝇位于暗室中，待明亮室开启光照后，打开闸门。
图2. 使用泛神经元驱动子过表达GFP或Tau的果蝇在负趋地性实验和APS实验中的代表性结果。 A. 在负趋地性实验中，10日龄的雄性（蓝色柱）或雌性（红色柱）过表达GFP的果蝇比过表达Tau的果蝇表现出更高的攀爬活性。 B. 20日龄的雌性过表达GFP果蝇在学习（PC0）和记忆（PC6）功能上优于过表达Tau的果蝇。
讨论
负向重力趋向性和APS检测均为稳健的行为学检测方法，可用于测量由遗传或环境干预引起的运动能力或学习记忆能力的变化。然而，这些检测方法仍存在一些有待进一步优化的缺点。
在负向重力趋向性实验中，某些基因的突变可导致果蝇出现严重的运动功能障碍。在这种情况下，果蝇在受到扰动后几乎无法响应重力而向上爬行。此时，可能更适合采用其他直接测量运动行为的实验方法。这些实验包括用于检测麻痹和惊厥的翻正反射行为10，以及记录运动协调性丧失的视动反应行为11。
在APS检测中，第一个障碍可能是果蝇在明亮室入口处随机停止，不再向前移动。如果研究条件中包含衰老因素，这一问题会更加突出，因为老年果蝇总体活动性较低，倾向于长时间停顿和休息。在这种情况下，实验人员必须提供机械刺激以促进其移动，但这种方法并不总是有效。第二，有人可能认为果蝇未能进入明亮室是由于丧失了正向趋光性。但这种情况极为罕见，因为先前的研究表明，一旦移除负性强化刺激，果蝇会恢复对光的反应能力4。第三，果蝇与厌恶刺激接触的持续时间可能在不同试验之间存在差异。通常可以通过在室的内壁周围放置浸湿的滤纸来减少这种变异，以防止果蝇避开奎宁。此外，实验人员还可以通过将果蝇在室内的停留时间从通常的1分钟延长，确保每只果蝇与滤纸有足够的接触时间。
总之，负向趋地性与APS检测是评估行为缺陷的快速简便方法，可定量反映动物的运动能力以及学习和记忆功能 果蝇这些检测方法在模拟人类神经退行性疾病方面尤为有用 果蝇.
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Charles Luetje博士提供了T型迷宫和行为实验房间。本研究由美国心脏协会（资助号：Y.A.）、国家神经疾病与卒中研究所R01NS64269基金（资助号：R.G.Z.）以及佩韦慈善信托基金（资助号：R.G.Z.）提供支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚苯乙烯小瓶 | Capitol Vial, Inc. | 28Fly | 28.5 × 95 mm 聚苯乙烯小瓶；材料质量至关重要，若表面过于光滑导致果蝇无法攀爬则不适用。 |
| 解剖立体显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1432-979 | 配备两个分支的鹅颈式导光管（12 V/30 W） |
| 盐酸奎宁 | Sigma-Aldrich | 6119-47-7 | 溶于蒸馏水中。 |
| 快速断开连接器 | Nalge Nunc international | 62868-021 | 高密度聚乙烯 |
| T型迷宫 | Simple Behavioral Systems | ||
| 单通道 200 μL 移液器 | Eppendorf | 022443305 |
参考文献
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Lloyd, T. E. &, Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).
- Le Bourg, E., Buecher, C. Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster. Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster. Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).
- Leal, S. M., Neckameyer, W. S. Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).
- Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons. Learn Mem. 11, 277-287 (2004).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 100, 597-614 (1982).
- Hall, J. C. Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system. J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).
重印与许可
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可