酵母殖民地嵌入方法

Summary

嵌入酵母菌菌落，允许光学和电子显微镜切片的一种方法。此协议允许孢子细胞的分布和假菌丝细胞内提供了一个新的工具，对理解组织类型的细胞内一种真菌社会的殖民地的决心。

Abstract

不同类型的细胞在胚胎的图案是一个后生发展的关键机制。殖民地和生物膜的微生物，如社区也显示细胞类型的模式。例如，在酵母S.的酵母 ，孢子细胞和假菌丝细胞不是均匀分布在菌落。图案和背后的分子机制，这些模式的功能的重要性仍然知之甚少。

调查真菌菌落的细胞类型模式的一个挑战是，不像后生动物的组织，细胞在殖民地比较弱连接到另一个。特别是，真菌菌落不包含在大多数组织中发现的细胞外基质的广泛的同一水平。在这里，我们报告上嵌入和切片酵母殖民地，揭示了在这些殖民地的细胞类型的内部模式的方法。该方法可用于准备厚切片，光镜和超薄切片（0.1μ）适合透射电子显微镜（0.5μ）有用。 ASCI和假菌丝细胞可以很容易地区别于卵形酵母细胞，通过光镜，而这些细胞的内部结构可以由EM观察。

该方法是基于对菌落周围的琼脂，渗透Spurr的培养基，然后切片。菌落直径在1-2毫米的范围内适用于本议定书。此外，以可视化的内部殖民地，该方法允许侵入底层琼脂的殖民地地区的可视化。

Protocol

1。殖民地隔离和固定

1. 指定的时间孵育300琼脂培养基上菌落（一个孤立的殖民地应在直径1-2毫米）。
2. 删除殖民地（正面朝上）及相关的媒介，使用一个狭窄的铲。
3. 将数滴2％琼脂42 ° C的载玻片，使用琼脂面对1毫升pipetman提示，并立即将殖民地之前巩固。
4. 置于42℃菌落数滴2％琼脂，并允许以巩固。
5. 穿手套的所有步骤，通过本协议的其余部分
6. 修剪块刀片，并将其放置在一个3.5毫升硼硅螺丝帽7天的2％多聚甲醛/ 2％戊二醛固定液的小瓶4 ° C。

2。清洗和锇治疗

1. 约1周后，洗下孵育15分钟，两次不够0.15米的钠cacodylate（pH 7.2）中，同体积的完全覆盖殖民地（约1.5毫升），然后5分钟两次化学通风柜在冰上的琼脂块1X操作系统缓冲区（100毫米KH ₂ PO ₄ 10毫米氯化镁_2，pH值6.0）。
2. 加入相同体积的1％OSO ₄ [2 OSO ₄毫升（2％）+ 2毫升2个操作系统的缓冲区]小瓶（冰）覆盖琼脂块化学通风柜下1小时，然后洗两次相同数额1X操作系统的缓冲区，每次10分钟。
3. 离开瓶过夜，在4 ° C的1X操作系统的缓冲区。
4. 固定液，并在此步骤中的所有洗作为危险....

Discussion

方法揭示了殖民地的内部结构。由于该方法是有效S 的范围内确定的细胞类型的模式酵母株不同的菌落形态，而且在一个相关的物种S. paradoxus ^5，该方法也有可能工作的真菌和其他微生物的广泛。

方法的成功的一个关键的步骤是，以确保整个殖民地，包括殖民地的顶部，是在整个协议的琼脂包裹。无论是殖民地完全包裹在琼脂可以切片光镜和甲苯胺蓝染色后才能确定。当染色切片光镜下观察，琼脂培养基上沾有略高于包埋剂暗。由于琼脂缩小在dehydrations步骤，以收回整个殖民地，一定要:1）添加4-5滴的琼脂可靠地覆盖在步骤1.2的殖民地，和2）修剪琼脂，只在两侧，而不是顶部和底部，只修剪足以允许它在模具适合在步骤1.5。

一个协议，以获得最佳的部分是关键的第二阶段涉及块包埋剂的硬度。典型的块检查孵育过夜后，从模具中取出。如果块仍然是灵活的双手之间举行，并弯曲，它们可能不是够硬切片。在这种情况下，他们返回到孵化器在相同的温度下增设48个小时以上复检。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
氧化锇	电子显微镜科学	RT 19152
有机硅包埋模具	Fisher Scientific	NC 9975029
脂环族环氧树脂	显微镜科学	RT 15004	ERL 4221
环氧树脂	电子显微镜科学	RT 13000	DER 736
壬基琥珀酸酐	电子显微镜科学	RT 19050	NSA
2-二甲基胺–thanol	电子显微镜科学	RT 13300	DMAE
封固剂	KPL Inc	71-00-16
旋转轮	Ted Pella， Inc.	Pelco 1055
切片机	Leica Microsystems	Ultracut S