酵母菌落包埋法

摘要

一种用于包埋酵母菌落的方法，可进行切片以用于光学显微镜和电子显微镜观察。该方案可确定菌落内孢子化细胞和假菌丝细胞的分布情况，为理解真菌群落中不同类型细胞的空间组织提供了新的工具。

摘要

胚胎中不同类型细胞的空间分布是后生动物发育的关键机制之一。微生物群落（如菌落和生物膜）也表现出细胞类型的分布模式。例如，在酵母菌S. cerevisiae中，孢子化细胞和假菌丝细胞在菌落中并非均匀分布。目前对这些分布模式的功能意义及其潜在的分子机制仍知之甚少。

研究真菌菌落中细胞类型分布模式的一个挑战在于，与多细胞动物组织不同，菌落中的细胞彼此之间的连接相对较弱。特别是真菌菌落不含有大多数组织中存在的丰富细胞外基质。本文报道了一种用于包埋和切片酵母菌落的方法，该方法可揭示这些菌落内部的细胞类型分布模式。该方法可用于制备适用于光学显微镜观察的厚切片（0.5 μm）以及适用于透射电子显微镜观察的薄切片（0.1 μm）。通过光学显微镜可轻松区分子囊和假菌丝细胞与卵圆形的酵母细胞，而这些细胞的内部结构则可通过电子显微镜进行观察。

该方法基于用琼脂包围菌落，使其浸透Spurr's介质，然后进行切片。直径在1-2 mm范围内的菌落适用于本实验方案。除了可观察菌落内部结构外，该方法还可用于观察菌落侵入下层琼脂区域的结构。

方案

1. 菌落分离与固定

1. 将300个菌落接种于琼脂培养基中，在指定时间内进行培养（单个分离菌落直径应为1-2 mm）。
2. 使用窄 spatula 将菌落（正面朝上）及其下方的培养基一同刮下。
3. 用1 mL移液器枪头吸取数滴42°C的2%琼脂，滴加至显微镜载玻片上，并立即在琼脂凝固前将菌落正面朝上放置其上。
4. 在菌落表面再滴加数滴42°C的2%琼脂，静置使其凝固。
5. 本实验后续所有步骤均需佩戴手套操作。
6. 用剃须刀片修整样品块，将其放入含有2%多聚甲醛/2%戊二醛固定液的3.5 mL硼硅酸盐螺口小瓶中，于4°C固定7天。

2. 洗涤与锇处理

1. 约1周后，在冰上化学通风橱内用0.15 M卡可基酸钠缓冲液（pH 7.2）清洗琼脂块，加入足量缓冲液完全覆盖菌落（约1.5 mL），孵育15分钟，重复两次；随后用相同体积的1×OS缓冲液（100 mM KH₂PO₄、10 mM MgCl₂，pH 6.0）再清洗两次，每次5分钟。
2. 在冰上化学通风橱中，向小瓶中加入等体积的1% OsO₄ [2 mL OsO₄（2%）+ 2 mL 2×OS缓冲液]，完全覆盖琼脂块，固定1小时，然后用相同体积的1×OS缓冲液清洗两次，每次10分钟。
3. 将小瓶置于4°C的1×OS缓冲液中过夜。
4. 本步骤中使用的所有固定剂及洗涤液均须作为危险废物处理。所有接触过OsO₄的移液器均用植物油冲洗3次。

3. 清洗与脱水

1. 次日早晨，使用巴斯德移液管，将琼脂块在冰上用与上述相同体积的冷水中洗涤两次，每次10分钟。
2. 依次用相同体积的25%、50%、75%、95%乙醇各洗涤10分钟，随后用100%乙醇洗涤两次，每次10分钟。最后在4°C下用100%乙醇浸泡过夜。
3. 本步骤中的所有洗涤液均应作为危险废物处理。

4. 斯珀尔树脂包埋剂制备

1. 次日早晨（尽可能早）在通风橱内，将以下溶液（EM Sciences）称取至一次性塑料烧杯中，以配制Spurr试剂。后续使用该试剂的所有操作均需在通风橱内进行。
   （ERL 4221 溶液 5 克）
   （DER 736 溶液 4 克）
   （NSA 溶液 13 克）
2. 在通风橱内使用搅拌子缓慢混合上述溶液，持续 20 分钟。
3. 加入 DMAE 溶液 0.15 克，按上述方法继续搅拌 20 分钟。
4. 在通风橱内对上述混合液脱气 1–2 小时。

5. Spurr 包埋剂渗透

1. 配制Spurr树脂后，立即用与上述相同体积的100%室温乙醇将琼脂块洗涤5次，每次10分钟。最后一次乙醇洗涤后，用巴斯德吸管吸去乙醇，使残留的乙醇刚好覆盖琼脂块。
2. 加入约等体积的Spurr树脂试剂（约0.5 mL），在室温下将小瓶置于旋转轮上旋转15分钟，然后静置30分钟。30分钟后，用巴斯德吸管完全移除溶液，再加入Spurr树脂以覆盖琼脂块（约1.5 mL），在室温下旋转15分钟，静置30分钟。重复更换Spurr树脂、旋转和孵育步骤3次。
3. 最后一次静置30分钟后，移除Spurr树脂，加入新鲜Spurr树脂覆盖琼脂块。让琼脂块在室温下静置4小时。
4. 更换Spurr树脂后旋转过夜。
5. 次日早晨更换Spurr树脂，并持续旋转至第二天。
6. 第二天早晨，将Spurr树脂加入编号的硅胶模具（Fisher Scientific）中，液面刚好覆盖模具底部，然后将琼脂块放入模具中。在60°C孵育4小时。
7. 4小时后，向模具中补加更多Spurr树脂至充满，然后在60°C过夜孵育。
8. 若将琼脂块从模具中取出后仍稍显柔软，应将其放回模具，并额外孵育2天。

6. 切片

1. 使用徕卡 Ultracut S 超薄切片机切割 0.5 μm 厚的切片用于光学显微镜观察，以及 0.1 μm 厚的切片用于透射电子显微镜。
2. 对于光学显微镜观察，切片在切割后被置于一滴去离子水（dH₂O）中，并在 52°C 的加热板上烘干。干燥后的切片用一滴 1.0% 甲苯胺蓝、1% 硼砂溶液染色 5–15 秒。染色后，立即用流水冲洗切片，干燥，滴加封片介质（KPL），盖上盖玻片并封固。

7. 代表性结果：

先前已有综述回顾了测量酵母及其他微生物中模式形成的广泛意义¹。尤为值得注意的是，相较于无序的微生物群体，有序的微生物菌落具有更高的功能性。

所述方法是对一种用于包埋较大特殊菌落的方法的改进²，我们对这一方法的改进已发表过简要描述³。

图1显示了野生型S. cerevisiae酵母菌落中心切片的光学显微镜图像示例。子囊、假菌丝和卵圆形酵母细胞易于区分，菌落侵入下方琼脂的区域也清晰可见。

图2显示了一张实验室酵母菌株（W303背景）的电子显微镜照片示例。该图像来自菌落中孢子化细胞频率较高的区域。

图 1. 野生酵母菌落的光学显微镜图像。该酵母菌株（YPS133）最近从树木渗出物中分离得到⁴。菌落在切片前于YNA培养基中培养6天⁵。空心箭头指示典型的子囊，实心箭头指示典型的卵圆形营养细胞，实心箭头头指示细长细胞链（假菌丝）及子囊。

图 2. 实验室酵母菌株的电子显微镜观察。SH1020 菌株（W303 背景）在 YNA 培养基上培养 6 天后进行切片³。图像显示切片中子囊出现频率较高的区域。箭头指示孢子壁的双层结构。

图3. 菌落中孢子形成细胞分布的定量分析：A) 将一个由15个沿长边相连的矩形组成的网格叠加在菌落切片图像的中央区域。在保持比例不变的情况下调整网格的大小，使其恰好覆盖菌落的顶部和底部。（B & C）通过目视检查4天龄（B）和8天龄（C）菌落的图像，确定每个矩形中孢子形成细胞占该矩形内总细胞数的比例。例如，菌落顶部的矩形（标记为“1”）对应于图中左侧。结果显示了4个菌落的平均值；误差线表示标准误差。

讨论

本方法可揭示菌落的内部结构。由于该方法在确定具有不同菌落形态的多种酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株以及相关物种S. paradoxus⁵中细胞类型的分布模式方面均有效，因此该方法也可能适用于多种真菌及其他微生物。

该方法成功的关键步骤之一是确保在整个实验过程中，整个菌落（包括菌落顶部）都被琼脂完全包裹。菌落是否被琼脂完全包埋，可在光学显微镜切片后经甲苯胺蓝染色观察确定。在光学显微镜下观察染色切片时，琼脂培养基的染色略深于包埋介质。由于琼脂在脱水步骤中会发生收缩，为确保完整回收菌落，务必做到：1）在步骤1.2中加入4-5滴琼脂，以可靠地覆盖菌落；2）在步骤1.5中仅修整琼脂的侧面，不要修整顶部和底部，且仅修整至能够放入模具即可。

影响切片质量的另一个关键步骤是包埋介质块的硬度。通常在过夜孵育后，将包埋块从模具中取出进行检查。若用手握住并弯曲时包埋块仍具有柔韧性，则其硬度可能不足以进行切片。此时应将包埋块放回原温度的培养箱中继续孵育额外48小时，并按上述方法重新检测。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四氧化锇	电子显微镜科学公司	RT 19152
硅胶包埋模具	费舍尔科技公司	NC 9975029
脂环族环氧树脂	电子显微镜科学公司	RT 15004	ERL 4221
环氧树脂	电子显微镜科学公司	RT 13000	DER 736
壬烯基琥珀酸酐	电子显微镜科学公司	RT 19050	NSA
2-二甲基氨基–乙醇	电子显微镜科学公司	RT 13300	DMAE
封片介质	KPL 公司	71-00-16
旋转轮	Ted Pella 公司	Pelco 1055
超薄切片机	徕卡显微系统公司	Ultracut S