酵母菌落包埋法

摘要

一种用于包埋酵母菌落的方法，可进行切片以用于光学显微镜和电子显微镜观察。该方案可确定菌落内孢子化细胞和假菌丝细胞的分布情况，为理解真菌群落中不同类型细胞的空间组织提供了新的工具。

摘要

胚胎中不同类型细胞的空间分布是后生动物发育的关键机制之一。微生物群落（如菌落和生物膜）也表现出细胞类型的分布模式。例如，在酵母菌S. cerevisiae中，孢子化细胞和假菌丝细胞在菌落中并非均匀分布。目前对这些分布模式的功能意义及其潜在的分子机制仍知之甚少。

研究真菌菌落中细胞类型分布模式的一个挑战在于，与多细胞动物组织不同，菌落中的细胞彼此之间的连接相对较弱。特别是真菌菌落不含有大多数组织中存在的丰富细胞外基质。本文报道了一种用于包埋和切片酵母菌落的方法，该方法可揭示这些菌落内部的细胞类型分布模式。该方法可用于制备适用于光学显微镜观察的厚切片（0.5 μm）以及适用于透射电子显微镜观察的薄切片（0.1 μm）。通过光学显微镜可轻松区分子囊和假菌丝细胞与卵圆形的酵母细胞，而这些细胞的内部结构则可通过电子显微镜进行观察。

该方法基于用琼脂包围菌落，使其浸透Spurr's介质，然后进行切片。直径在1-2 mm范围内的菌落适用于本实验方案。除了可观察菌落内部结构外，该方法还可用于观察菌落侵入下层琼脂区域的结构。

方案

1. 菌落分离与固定

1. 将300个菌落接种于琼脂培养基中，在指定时间内进行培养（单个分离菌落直径应为1-2 mm）。
2. 使用窄 spatula 将菌落（正面朝上）及其下方的培养基一同刮下。
3. 用1 mL移液器枪头吸取数滴42°C的2%琼脂，滴加至显微镜载玻片上，并立即在琼脂凝固前将菌落正面朝上放置其上。
4. 在菌落表面再滴加数滴42°C的2%琼脂，静置使其凝固。
5. 本实验后续所有步骤均需佩戴手套操作。
6. 用剃须刀片修整样品块，将其放入含有2%多聚甲醛/2%戊二醛固定液的3.5 mL硼硅酸盐螺口小瓶中，于4°C固定7天。

2. 洗涤与锇处理

1. 约1周后，在冰上化学通风橱内用0.15 M卡可基酸钠缓冲液（pH 7.2）清洗琼脂块，加入足量缓冲液完全覆盖菌落（约1.5 mL），孵育15分钟，重复两次；随后用相同体积的1×OS缓冲液（100 mM KH₂PO₄、10 mM MgCl₂，pH 6.0）再清洗两次，每次5分钟。
2. 在冰上化学通风橱中，向小瓶中加入等体积的1% OsO₄ [2 mL OsO₄（2%）+ 2 mL 2×OS缓冲液]，完全覆盖琼脂块，固定1小时，然后用相同体积的1×OS缓冲液清洗两次，每次10分钟。
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讨论

本方法可揭示菌落的内部结构。由于该方法在确定具有不同菌落形态的多种酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株以及相关物种S. paradoxus⁵中细胞类型的分布模式方面均有效，因此该方法也可能适用于多种真菌及其他微生物。

该方法成功的关键步骤之一是确保在整个实验过程中，整个菌落（包括菌落顶部）都被琼脂完全包裹。菌落是否被琼脂完全包埋，可在光学显微镜切片后经甲苯胺蓝染色观察确定。在光学显微镜下观察染色切片时，琼脂培养基的染色略深于包埋介质。由于琼脂在脱水步骤中会发生收缩，为确保完整回收菌落，务必做到：1）在步骤1.2中加入4-5滴琼脂，以可靠地覆盖菌落；2）在步骤1.5中仅修整琼脂的侧面，不要修整顶部和底部，且仅修整至能够放入模具即可。

影响切片质量的另一个关键步骤是包埋介质块的硬度。通常在过夜孵育后，将包埋块从模具中取出进行检查。若用手握住并弯曲时包埋块仍具有柔韧性，则其硬度可能不足以进行切片。此时应将包埋块放回原温度的培养箱中继续孵育额外48小时，并按上述方法重新检测。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四氧化锇	电子显微镜科学公司	RT 19152
硅胶包埋模具	费舍尔科技公司	NC 9975029
脂环族环氧树脂	电子显微镜科学公司	RT 15004	ERL 4221
环氧树脂	电子显微镜科学公司	RT 13000	DER 736
壬烯基琥珀酸酐	电子显微镜科学公司	RT 19050	NSA
2-二甲基氨基–乙醇	电子显微镜科学公司	RT 13300	DMAE
封片介质	KPL 公司	71-00-16
旋转轮	Ted Pella 公司	Pelco 1055
超薄切片机	徕卡显微系统公司	Ultracut S