改进的可视化和定量分析，药物使用Micropatterned细胞的影响

Summary

可用于胶粘剂的微图案，细胞结构正常化，增加检测药物作用的敏感性，改善的重现性和简化自动化图像采集和分析。这种技术将有利于药物/ siRNA的筛选试验，进行常规的细胞培养支持，并因此遭受过度的细胞 - 细胞变性。

Abstract

迄今为止，最HCA（高含量的分析）的研究进行了贴壁细胞，在组织文化的同质性治疗微板的衬底上生长。在这些条件下，细胞的扩散，并在所有方向，在细胞的形状，形态和行为的内在变化导致分裂。高整体人口的细胞与细胞之间的差异阻碍了HCA的成功，特别是为药物开发。微图案的能力，每一个单个细胞的形状和内部极性正常化提供了一个巨大的机会， ^解决这个关键瓶颈1-2。

为了便于访问和使用的缩微技术，CYTOO已开发出了一系列准备使用微图案，在盖玻片和微孔格式。在这个视频文章中，我们提供详细的协议CYTOOchip微图案，药物治疗，固定和染色的自动采集，自动图像处理和分析，最终的数据，从细胞播种的所有程序。这个例子中，我们说明如何微图案，可以促进细胞检测。细胞骨架的改变是难以量化同质衬底上培养的细胞，但培养细胞中的肌动蛋白小梁由于在每一个细胞的细胞粘附接触系统定位重现性组织的微图案业绩。这种细胞内的结构正常化，使量化的肌动蛋白细胞骨架上，甚至小的影响，证明在这些协议使用blebbistatin，肌动蛋白 - 肌球蛋白相互作用的抑制剂。

Protocol

1。细胞微图案的制备和播种

1. 放置2 2 6孔板独立井CYTOOchips确保您阅读"CYTOO"在右下角的CYTOOchip。微图案可以被荧光标记Cy3或Cy5的染料。本实验所用的CYTOOChips Cy3标记有荧光标记的微图案。
   注意:请在黑暗中的芯片。
2. 胰蛋白酶消化收集HeLa细胞（〜80％融合）。在显微镜下检查，适当分散的胰蛋白酶处理细胞。收集和离心机300克细胞为4分钟，然后轻轻悬浮细胞沉淀。计数细胞，稀释到15000完成的DMEM/F12培养基中的细胞/毫升的浓度。
3. 免除到以及包含每一个CYTOOchip 4毫升（60,000细胞）。
   注意:该板块应尽可能少移动，以避免诱导培养基中的任何旋转运动，因为这往往会集中在细胞的中心。
4. 让我们为10分钟引擎盖下的细胞沉淀物，然后将它们移动到细胞培养箱。 10-20分钟后，细胞就会开始坚持的微图案。 10分钟后，定期检查，在显微镜下。
5. 只要细胞连接，改变细胞培养基，轻轻冲洗盖玻片表面，使用下列程序:
6. 保持板式平，轻轻地从一侧以及吸管中吸。
   注意:绝不能让芯片干出来的，这意味着，从未吸过所有的液体，但留出足够的覆盖在任何时候都CYTOOchip。
7. 添加4毫升PBS，首先在芯片的中心开始，然后移动到一侧以及再次吸。吸过的PBS不暴露在空气中的芯片。重复3-4次。
8. 浮动细胞在显微镜下检查:
   • 如果大量的浮动细胞仍然存在，重复洗涤过程。
   • 如果你看到极少数的细胞，吸出的PBS和2毫升的新鲜培养基代替。吸的新鲜培养基中添加4毫升两次。
9. 在组织培养箱内培养板放置在37℃，5％的_CO 2至少三个小时，让细胞来实现全面蔓延。
   注意:使用这种方法之间的10-30％（2000-6500）将被占用一个或多个细胞微图案。
   注意:坚持之前的洗涤步骤和全细胞微图案的蔓延将具体到每个细胞株所需的时间为细胞所需的时间。

2。 Blebbistatin治疗

1. 在100％DMSO溶解blebbistatin获得一个17毫米的股票解决方案。进一步原液稀释至5毫米，100％DMSO。请在培养基中的最终稀释获得了5微米blebbistatin终浓度在0.1％DMSO。
2. 对于控制条件，准备4毫升含0.1％DMSO的唯一媒介。
3. 吸细胞上的媒体和替换治疗和控制的条件下编制的4毫升中等。
4. 孵育细胞1小时在37 ° C。

3。肌动蛋白细胞固定和染色

1. 细胞固定的解决方案准备
   请参阅为骨架缓冲液（CB）和PFA 5％的制备试剂部分。 CB是特别推荐的微丝和微管的荧光标记。
   • 准备1xCB蔗糖:蔗糖加1克至2毫升的CB。
     包括蔗糖，有助于保护内部的细胞结构。
   • 准备4％PFA - CB -蔗糖:温暖的煤灰5％至4毫升加入1毫升的1xCB蔗糖。
     注意:此解决方案可保持在4℃，只几天。
2. 煤灰固定
   • 使用镊子CYTOO标志，并把它拿起CYTOOchip 6井以及含2毫升4％PFA - CB -蔗糖溶液板（不洗）
   • 在室温下孵育10分钟
   • 删除PFA - CB -蔗糖，用PBS洗一次
   • 做了2毫升100毫米的NH ₄氯10分钟的第二次洗，以淬火残余煤灰交联活动
     注:煤灰固定幻灯片可以在PBS存放数天，在4 °彗星之前，细胞器染色荧光成像。
3. 与Triton X - 100的细胞膜的通透性，
   用洗涤剂的细胞通透性，使抗体或其他探针穿透细胞膜，并消除了一些细胞骨架蛋白的胞质池，否则可以减少使其难以分析其本地化的骨架聚合物的对比。
   • 删除NH _{4 CL，}并加入2 ml / 0.1％TRITON X - 100 - CB在室温下3分钟
   • 用2 mL PBS洗两次
4. 肌动蛋白染色
   荧光-鬼笔环肽h本土肌动蛋白结合不仅是用来染色的微丝。
   • 添加1.5％BSA 2毫升的PBS 1:2000稀释的FITC标记的鬼笔环肽
   • 在室温下孵育1小时
   • 用2 mL PBS洗一次
5. 核染色
   • 加入2毫升的赫斯特（1μg/毫升染色的PBS）
   • 在室温下孵育3分钟
   • 用2 mL PBS清洗2次
6. 安装幻灯片
   • 拿起CYTOO标志和装载CYTOOchip CYTOOchips到一个标准的显微镜使用25-30μLMowiol或任何其他的安装解决方案的幻灯片。

4。显微镜的安装和自动图像采集

存在大量的成像软件包，控制快速自动图像采集和显示的显微镜。这个例子使用Metamorph成像软件和配备尼康的Eclipse TI滨松与CCD相机Intensilight汞光纤照明显微镜进行自动采集。获得相应的DAPI（核），CY - 3（微图案）和FITC -鬼笔环肽（肌动蛋白）在三种波长的20倍放大倍率的图像。微图案的数量，可视化的每场相机和目标设置上会有所不同而有所不同。 CYTOO微图案是定位在每个跨越大大方便采集芯片（100或130微米）定义的时间间隔。

1. 选择20倍的放大倍率
2. 打开多维收购（在菜单栏:应用程序/多维收购），并设置不同的实验参数:
   • 波长数:3
   • 波长类型:DAPI，FITC，Cy3标记
   • 每个波长的曝光时间设置，首先在重点领域的细胞
   • 每个波长可以进行自动对焦
   • 选择在哪里保存数据
3. 选择Cy3标记的波长和相机的位置，使12微图案可视化，并在相机领域（4列和第3行模式）为中心。
4. 创建一个日志，运行多维收购。图1描述创建一个杂志的过程。
5. 打开扫描阶段的功能（在菜单栏:设备/舞台/扫描阶段）。要获取24幅图像，每片含12微图案，在20倍的放大倍率，输入-400微米X步骤大小和300微米Ÿ步长和4行6列。在设置杂志执行，上传杂志MDA.JNL。然后按下扫描开始在三种波长的整幢大厦的自动采集。
   注:X和Y的步长在此间表示将根据目前在相机领域的微图案。根据你的舞台设置，在X和/或Y方向可能需要在正确的方向运动时的负值。

5。自动图像处理和分析

存在许多图像处理和分析软件包。下面描述的过程的轮廓图像处理和分析步骤2定制，为开源项目ImageJ编写的宏进行。第一个宏CellRef创建引用单元，第二斜边措施刚性/细胞膜的崩溃。两者都是通过请求后可www.cytoo.com 。

1. 微图案（宏CellRef）为中心的所有三个通道的创建图像堆栈。
   微图案的使用，避免细胞集群和聚集，大大简化了在自动化图像处理的第一步，这是单个细胞的本地化和分割。微型图象荧光标记的图像是用于定义和划定的微图案为中心的地区。然后，这些地区调换到其他渠道获得的的图像和裁剪。每个波长堆叠，然后组装成相应的裁剪图像。从三个通道（图2）合并也创造了一个RGB叠。
2. 应用单细胞选择过滤器（宏CellRef）
   如上所述，10-30％的微图案（2000-6500）被占领的单个单元格或多个单元格，而其余的微图案是空的。要选择占用只是一个单细胞微图案的图像显示，宏观检测每幅图像的原子核的数目，并从所有协议栈（RGB和不同波长的）那些包含多个细胞核或没有细胞核（图3）消除。
3. 消除非标准化和细胞不完全拉长整个微型图象使用单元面积截止滤光片（宏CellRef）
   要删除分裂的细胞会逃脱原子核的过滤器，另一个过滤器使用FITC标记的肌动蛋白通道应用。单元面积计算低于某一切断（2倍左右的单元格相间细胞面积低于地区）的所有堆栈中删除。格局的大小，是由细胞信封面积。
4. 从前面的步骤，包含单micropatterned细胞的图像被选中。即使这些图像上微图案为中心，他们从来没有完全对齐彼此。要结束的图像处理，ImageJ插件（MultiStackReg）是适用于重新调整所有收集到的图像和所有渠道的基础上的微型图象的位置。这一步，​​现在可以用于单细胞分析或创建引用单元（图4）个别图像生成对齐栈
5. 构建参考单元（宏CellRef）
   在微图案上生长的细胞，意味着所有的细胞也有类似的形状。这正常化，允许许多细胞图像精确对准和覆盖。总结在整个堆栈每个图像信号允许一个可视化和衡量一个"平均药物作用"。最后的整体形象，或参考细胞是一个独特的代表性和图像分析和有用的工具，只能获得micropatterned细胞（图4）。 ImageJ，引用单元格是通过从堆栈的过滤和对齐图像投影构造（图像>书库> Z项目）。几个投影方法可应用于如平均或最大强度，消除图像堆栈的主要离群，但通常的平均预测是选择。为了便于检查的结果，一个LUT（查找表）的单色图像转换成一种颜色编码的频率地图。
6. 测量和量化感兴趣的参数（宏观斜边）
   在这个视频文章中，L - 微图案是因为形式组织成一个主要的应力纤维肌动蛋白细胞骨架。突出以这种方式肌动蛋白，blebbistatin的细胞骨架的影响可确定在许多方面:测量的肌动蛋白压力纤维的曲率变化，染色应力纤维的强度，长度或厚度，改变的肌动蛋白细丝的形态特点或细胞的形状等，这些参数可以测量单个细胞的图像，或在最后的参考细胞本身。
   在这里，5微米blebbistatin影响的特点是通过使用一个名为斜边（图7）第二ImageJ宏观倒塌细胞计数的数量。简单地说，在L -微型图象的阈值的图像被用来定义一个单元格的三角形状的理论斜边。下，肌动蛋白染色图像进行阈值是为了近似实际的细胞形态。然后测量理论的细胞三角形和实际凹细胞膜的斜边之间的区域。当细胞已经坍塌，下面的理论斜边的面积出现。倒塌细胞的百分比是用来比较的控制和治疗条件。

6。代表性的成果

什么细胞的例子应立即上微图案看起来像几个小时后，关键在1.6-1.8洗中描述的步骤，如图5所示。上CYTOOchips 15分钟后，圆形的HeLa细胞的观察表明，他们坚持的纤维连接蛋白微图案（图5a）的距离相等。尽管轻轻摇动培养容器固定细胞时，附着力完成。为了尽量减少占用微图案由多个细胞的数量，芯片，然后用PBS冲洗，以去除细胞漂浮在cytophobic地区。几个小时后，细胞在微图案完全伸展，如图5b所示的样子。

典型的单细胞blebbistatin，固定和肌动蛋白和核染色的细胞孵化后获得的图像，如图6。后的自动采集多个图像和图像处理使用ImageJ CellRef宏观，颜色编码的频率地图生成，描述了肌动蛋白的强度平均每所有细胞图像（图6C和6F）。引用单元格非治疗和治疗条件的比较，表明这种方法容易观察所研究的表型的潜力，并为探索细胞的药物影响是特别有用。

blebbistatin对细胞的作用可能分析的一个例子是在图7。倒塌的细胞数（即细胞与一个空白的理论斜边下，现有面积）在50个控制细胞检测，显示50个细胞治疗5微米blebbistatin ImageJ斜边宏检测。倒塌细胞blebbistatin处理人口数量增加，反映的应力纤维，因此在膜由于blebbistatin actinomyosin收缩力量抑制细胞内的紧张放松。

图1的过程来创建一个新的杂志与Metamorph 。

图2的自动图像处理程序流程图。

图3，单细胞筛选。

图4。建立一个参考电池。

图5。细胞种植。一）Hela细胞后冲洗的步骤（4倍的放大倍率）坚持以微图案二）HeLa细胞L上的微图案（10倍的放大倍率）经过充分的蔓延。

图6。nonpatterned控制和药物治疗的条件和micropatterned细胞的比较。 HeLa细胞接种3小时和5 1小时微米blebbistatin（下半部）或不及时治疗（上图）的治疗。在控制nonpatterned细胞（A），肌动蛋白组装成多种纤维5微米blebbistatin（四）治疗后潜移默化地拆卸的。对L -微图案，对照组采用一个三角形状（二）发展一个重要的肌动蛋白纤维之间2根尖相比属nonpatterned细胞（D）（应力纤维），blebbistatin诱使一个重要的表型改变对L - micropatterned细胞（E）。迅速与20细胞构建的引用单元格介绍药物作用，控制和治疗条件比较直接的可视化，可可视化。单个细胞相似，一个清晰而强烈的应力纤维是目前控制参考单元（C），而blebbistatin处理细胞崩解和消失的主要应力纤维（F）。

图7。使用宏Hypothenuse细胞blebbistatin影响分析的一个例子。而对照组的25％倒塌，这增加了3倍，75％在5微米blebbistatin接受反映削弱actinomyosin收缩网络（N = 50个细胞）的细胞。

Discussion

选择的微型图象

虽然5微米blebbistatin的影响几乎是标准的文化支持检测的，有效的量化是集中到一个主要的应力纤维的肌动蛋白的微图案。这增强了可视化协助对细胞blebbistatin的影响的准确定量的肌动蛋白细胞骨架。微型图象形状的选择是在实验的设计关键，是根据在研究中强调的表型改变设计。

结论

微图案方便的药物效果的可视化和量化，特别是在低浓度。与基于细胞的检测胶粘剂微图案同质平面基板的更换，提高了生产数据的准确性，灵敏度和质量。结果，需要较少的细胞进行分析，以实现强大的统计^结果 3 。胶粘剂微图案提供了一个真正的机会，改善功能的研究和探索在较低药物浓度的表型变化，以避免诱发有毒或间接的药物效果。如果使用适当的筛选平台，微图案能满足制药公司的要求，为提高基因/药物筛选应用。分析和定量分析细胞的现象，利用微图案的一些额外的例子，最近的出版物被^引用低于3-13。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称		公司	目录编号	评论
细胞培养
CYTOOchips 20X20的LM - FN		CYTOO	10-114	您所选择的蛋白质吸附CYTOOchips
PBS 1X		Gibco公司	14040-091
计数室（Kova幻灯片）		Prolabo	71287.01
DMEM/F-12 + Glutamax，我		GIBCO，Invitrogen公司	25300-054
胎牛血清（f TAL牛血清）		临时机场管理局	31331-028
青霉素和链霉素		临时机场管理局	A15 - 101
6井板		Dutscher	353046
离心分离		Fisher Scientific则	M65838
显微镜		尼康
毒品，固定和免疫
骨架缓冲1X（CB）		西格玛	MES:M8250 氯化钾:I2636 氯化镁:M2393 EGTA:E3889	10毫米MES pH值6.1，138mM氯化钾， 3MM氯化镁， 2MM EGTA
蔗糖		西格玛	S2395
煤灰32％		电子显微镜科学	15714
煤灰5％				混合54毫升CB 1.185X 10毫升32％煤灰
TRITON - X100		西格玛	T9284
PBS片		GIBCO，Invitrogen公司	18912-014
Bovin血清白蛋白（BSA）		西格玛	A7806
Phallodin - FITC		西格玛	P5282
赫司特		Invitrogen公司	H3570
Blebbistatin		Euromedex	BN0640
二甲基亚砜		西格玛	D8418
NH 4氯0.1M		西格玛	M11209
图像采集
啶显微镜		尼康	Eclipse的钛
CCD相机		待定	待定
ImageJ软件		http://rsbweb.nih.gov/ij/