利用微图案化细胞改善药物效应的可视化与定量分析

摘要

能够正常化细胞结构的黏附性微图案可用于提高药物效应检测的灵敏度，改善实验重复性，并简化自动图像采集与分析。该技术将有助于在传统细胞培养支持物上进行的药物/siRNA筛选实验，此类实验通常因细胞间变异性过大而受限。

摘要

迄今为止，大多数高内涵分析（HCA）研究均采用在组织培养处理过的微孔板中、于均质基底上生长的贴壁细胞系进行。在此类条件下，细胞向各个方向铺展和分裂，导致细胞形态、结构和行为存在固有的变异性。整个细胞群体中较高的细胞间差异性阻碍了高内涵分析的成功应用，尤其是在药物开发领域。微图案技术能够使每个细胞的形态和内部极性均一化，为解决这一关键瓶颈提供了巨大机遇^1-2。

为了促进微图形化技术的应用与使用，CYTOO 开发了一系列即用型微图形，提供盖玻片和微孔板两种格式。在本视频文章中，我们详细介绍了从细胞接种到 CYTOOchip 微图形上、药物处理、固定与染色，再到自动图像采集、自动图像处理以及最终数据分析等所有步骤的操作方案。通过该示例，我们展示了微图形如何促进基于细胞的检测分析。在均质基底上培养的细胞中，细胞骨架的改变难以量化；而将细胞培养在微图形上时，由于每个细胞的黏附接触位置均系统性地被固定，导致肌动蛋白网络呈现出可重复的组织结构。这种细胞内结构的标准化使得即使是对肌动蛋白细胞骨架产生微小影响的效应也能够被量化，本文所述的一系列操作方案即通过使用肌动蛋白-肌球蛋白相互作用抑制剂——苯并吡喃酮（blebbistatin）——证明了这一点。

方案

1. 细胞准备及在微图形上的接种

1. 将 2 个 CYTOOchips 分别放入 6 孔板的 2 个独立孔中，确保在 CYTOOchip 的右下角能看到“CYTOO”字样。 微图案可用 Cy3 或 Cy5 荧光染料标记。本实验所用的 CYTOOChips 具有 Cy3 荧光标记的微图案。
   注意： 请将芯片避光保存。
2. 通过胰蛋白酶消化收集 HeLa 细胞（约 80% 汇合度）。在显微镜下检查细胞是否已被胰蛋白酶充分分散。收集细胞并在 300g 离心 4 分钟，然后轻轻重悬细胞沉淀。计数细胞，并用完全 DMEM/F12 培养基稀释至浓度为 15,000 个细胞/mL。
3. 向每个含有 CYTOOchip 的孔中加入 4 mL（60,000 个细胞）细胞悬液。
   注意： 应尽量减少移动培养板，以避免培养基产生旋转流动，否则会导致细胞向中心聚集。
4. 在生物安全柜中静置 10 分钟使细胞沉降，然后转移至细胞培养箱。10–20 分钟后，细胞将开始黏附于微图案上。10 分钟后，需定期在显微镜下观察。
5. 一旦细胞完成黏附，更换培养基，并按以下步骤轻轻冲洗盖玻片表面：
6. 保持培养板水平，用移液器从孔的侧边轻轻吸除培养基。
   注意： 切勿让芯片干燥，即不得将所有液体完全吸净，应始终保留足够覆盖 CYTOOchip 的液体。
7. 加入 4 mL PBS，然后先从芯片中心开始吸除，再移向孔的侧边。按上述方法吸除 PBS，过程中避免芯片暴露于空气中。重复此步骤 3–4 次。
8. 在显微镜下检查是否有漂浮细胞：
   • 若仍有大量漂浮细胞，重复洗涤步骤。
   • 若仅见极少量细胞，可吸除部分 PBS，并补充 2 mL 新鲜培养基。随后吸除并更换 4 mL 新鲜培养基，重复两次。
9. 将培养板置于 37°C、5% CO₂ 的组织培养孵箱中至少孵育 3 小时，以使细胞充分铺展。
   注意： 采用此方法时，约有 10–30%（2000–6500 个）的微图案会被单个或多个细胞占据。
   注意： 细胞在洗涤步骤前的黏附时间，以及细胞在微图案上完全铺展所需的时间，因不同细胞系而异。

2. 布来比星处理

1. 将漂白菌素溶解于100% DMSO中，配制成17 mM的储存液。再用100% DMSO将储存液稀释至5 mM。最后用培养基进一步稀释，获得终浓度为5 μM漂白菌素、含0.1% DMSO的溶液。
2. 对于对照条件，准备仅含0.1% DMSO的4 mL培养基。
3. 吸除细胞上的培养基，分别替换为4 mL已配制好的处理组和对照组培养基。
4. 将细胞在37°C下孵育1小时。

3. 细胞固定与肌动蛋白染色

1. 细胞固定的溶液配制
   请参见试剂部分以获取细胞骨架缓冲液（CB）和5% PFA的配制方法。CB特别推荐用于肌动蛋白丝和微管的荧光标记。
   • 配制1×CB-蔗糖：将1 g蔗糖加入2 mL CB中。
     添加蔗糖有助于保持细胞内部结构的完整性。
   • 配制4% PFA-CB-蔗糖：将1 mL 1×CB-蔗糖加入4 mL温热的5% PFA中。
     注意：该溶液仅可在4°C保存数天。
2. PFA固定
   • 使用镊子夹住CYTOO芯片上的CYTOO标志处，将其（无需洗涤）放入含有2 mL 4% PFA-CB-蔗糖溶液的6孔板孔中
   • 在室温下孵育10分钟
   • 移除PFA-CB-蔗糖溶液，并用PBS洗涤一次
   • 用2 mL 100 mM NH₄Cl溶液在室温下进行第二次洗涤，持续10分钟，以淬灭残留的PFA交联活性
     注意：PFA固定的载片可在4°C的PBS中保存数天，再进行细胞器染色用于荧光成像。
3. 使用Triton X-100对细胞膜进行通透处理
   利用去垢剂对细胞进行通透处理，可使抗体或其他探针穿透细胞膜，并去除部分细胞质中的细胞骨架蛋白，否则这些蛋白可能降低细胞骨架多聚体的对比度，从而影响其定位分析。
   • 移除NH₄Cl溶液，每孔加入2 mL含0.1% Triton X-100的CB溶液，在室温下处理3分钟
   • 用2 mL PBS洗涤两次
4. 肌动蛋白染色
   荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin）仅结合天然构象的肌动蛋白，用于染色肌动蛋白丝。
   • 加入2 mL PBS中含有1.5% BSA和1:2000稀释的FITC标记鬼笔环肽溶液
   • 在室温下孵育1小时
   • 用2 mL PBS洗涤一次
5. 细胞核染色
   • 加入2 mL Hoechst染液（在PBS中浓度为1 μg/mL）
   • 在室温下孵育3分钟
   • 用2 mL PBS洗涤两次
6. 载片封片
   • 用镊子夹住CYTOO芯片上的CYTOO标志处，将CYTOO芯片置于标准显微镜载玻片上，滴加25–30 μL Mowiol或其他封片剂进行封片。

4. 显微镜设置与自动图像采集

存在多种成像软件包，可用于控制显微镜以实现快速自动化的图像采集与显示。本示例使用 Metamorph 成像软件，在配备 CCD Hamamatsu 相机和 Intensilight 汞光纤照明器的 Nikon Eclipse Ti 显微镜上进行自动采集。图像以 20 倍放大倍数在三个波长下采集，分别对应 DAPI（细胞核）、Cy-3（微图形）和 FITC-Phalloidin（肌动蛋白）。每视野中可视化的微图形数量将根据相机和物镜设置的不同而有所变化。CYTOO 微图形在芯片上以固定间距（100 或 130 μm）相互排列，极大地方便了图像采集。

1. 选择 20 倍物镜
2. 打开多维采集功能（菜单栏中：Apps/Multidimensional Acquisition），并设置实验的各项参数：
   • 波长数量：3 个
   • 波长类型：DAPI、FITC、Cy3
   • 通过先聚焦于一个细胞视野，设置每个波长的曝光时间
   • 可对每个波长执行自动对焦
   • 选择数据保存位置
3. 选择 Cy3 波长，并调整相机位置，使相机视野中显示并居中 12 个微图案（4 列 × 3 行）。
4. 创建一个运行多维采集的程序脚本（journal）。创建程序脚本的步骤见图 1。
5. 打开扫描载物台功能（菜单栏中：Devices/Stage/Scan Stage）。为了在 20 倍放大倍数下获取 24 幅图像（每幅图像包含 12 个微图案），请设置 6 列和 4 行，X 步长为 -400 μm，Y 步长为 300 μm。在“Set Journal to Execute”中上传程序脚本 MDA.JNL，然后点击“Scan”以启动在三个波长下对整个区域的自动图像采集。
   注意：此处列出的 X 和 Y 步长会根据相机视野中微图案的数量而变化。根据载物台的设置，X 和/或 Y 方向可能需要使用负值才能实现正确方向的移动。

5. 自动化图像处理与分析

目前存在许多图像处理与分析软件包。以下所述步骤概述了使用开源程序 ImageJ 的两个自定义宏所执行的图像处理与分析流程。第一个宏 CellRef 用于创建参考细胞，第二个宏 Hypotenuse 用于测量细胞膜的刚性或塌陷程度。这两个宏可通过访问 www.cytoo.com 申请获取。

1. 创建以微图形为中心的三个通道的图像堆栈（宏 CellRef）。
   使用微图形可避免细胞聚集和成团，从而大大简化自动图像处理的第一步，即单个细胞的定位与分割。利用荧光标记的微图形图像来定义并划定以微图形为中心的区域，然后将这些区域转置到其他通道获取的图像上并进行裁剪。随后将对应的裁剪图像按各波长组装成图像堆栈。同时，还将三个通道合并生成一个RGB图像堆栈（图2）。
2. 应用单细胞选择滤波器（宏 CellRef）
   如上所述，10-30%（2000-6500）的微图形被单个细胞或多个细胞占据，其余微图形为空。为了筛选出仅被单个细胞占据的微图形图像，该宏会检测每幅图像中的细胞核数量，并从所有堆栈（RGB及不同波长）中剔除包含多个细胞核或无细胞核的图像（图3）。
3. 使用细胞面积截断滤波器剔除未归一化及未完全伸展覆盖微图形的细胞（宏 CellRef）
   为去除可能逃逸核筛选的分裂期细胞，需在FITC通道（标记肌动蛋白）中应用另一个滤波器。计算细胞面积，并将低于特定阈值（约为间期细胞面积的1/2）的细胞从所有堆栈中剔除。细胞包膜面积由微图形的尺寸决定。
4. 对齐细胞图像（宏 CellRef）
   通过前述步骤，已筛选出包含单个微图形化细胞的图像。尽管这些图像均以微图形为中心，但彼此之间并不完全对齐。为完成图像处理，使用ImageJ插件（MultiStackReg）根据微图形的位置对所有采集的图像及所有通道进行重新对齐。此步骤生成对齐后的单个图像堆栈，可用于后续的单细胞分析或构建参考细胞（图4）。
5. 构建参考细胞（宏 CellRef）
   在微图形上培养细胞意味着所有细胞具有相似的形态。这种归一化特性使得大量细胞图像能够精确对齐与叠加。通过对整个堆栈中每幅图像的信号进行累加，可以可视化并测量“平均药物效应”。最终的整体图像，即参考细胞，是图像表征与分析中独特而有用的工具，仅可通过微图形化细胞获得（图4）。在ImageJ中，参考细胞通过将过滤并对齐后的图像堆栈进行投影生成（图像>堆栈>Z-投影）。可采用多种投影方法，如平均强度或最大强度投影，但通常选择中值投影，以消除图像堆栈中的主要异常值。为便于结果观察，应用LUT（查找表）将单色图像转换为彩色编码的频率图。
6. 测量与量化感兴趣参数（宏 Hypotenuse）
   本视频文章中使用L形微图形，因其形状可将肌动蛋白细胞骨架组织成单一的主要应力纤维。通过此种方式突出肌动蛋白，可从多个方面评估blebbistatin对细胞骨架的影响：测量肌动蛋白应力纤维的曲率变化、染色强度、长度或厚度，肌动蛋白丝的形态学特征或细胞形状的变化等。这些参数既可在单个细胞图像上测量，也可直接在最终的参考细胞上进行。
   此处，通过使用名为Hypotenuse的第二个ImageJ宏计数塌陷细胞的数量，来表征5 μM blebbistatin的作用（图7）。简而言之，首先对L形微图形的图像进行阈值处理，以定义细胞三角形状的理论斜边；随后对肌动蛋白染色图像进行阈值处理，以近似实际细胞形状。然后测量细胞三角形的理论斜边与实际凹形细胞膜之间的区域面积。当细胞发生塌陷时，理论斜边下方会出现一定面积。通过计算塌陷细胞的百分比，用于比较对照组与处理组条件。

6. 代表性结果

图5展示了在1.6-1.8步骤所述关键清洗操作后即刻以及数小时后，细胞在微图案上的预期形态。在CYTOOchips上培养15分钟后，可见呈圆形的HeLa细胞以相等间距分布，表明细胞已黏附于纤连蛋白微图案上（图5a）。当细胞在轻轻摇动培养容器后仍保持固定不动时，说明黏附过程已完成。为减少多个细胞占据同一微图案的情况，随后用PBS冲洗芯片，以去除漂浮在抗细胞黏附区域上方的细胞。数小时后，充分伸展的细胞将呈现如图5b所示的形态。

在细胞经漂白菌素处理、固定以及肌动蛋白和细胞核染色后获得的典型单细胞图像如图6所示。通过ImageJ CellRef宏自动采集多幅图像并进行图像处理后，生成一幅颜色编码的频率图，显示了所有细胞图像中肌动蛋白强度的平均值（图6c和6f）。对照细胞在未处理与处理条件下的比较结果表明，该方法可便捷地观察目标表型，尤其适用于细胞药物效应的探索。

图7展示了一个关于柔红霉素对细胞作用效果的可能分析示例。通过ImageJ斜边宏检测，在50个对照细胞和50个用5 μM柔红霉素处理的细胞中检测到的塌陷细胞（即理论斜边下方存在空白区域的细胞）数量如图所示。经柔红霉素处理的细胞群体中塌陷细胞数量增加，反映出细胞内应力纤维的松弛，以及由于柔红霉素抑制了肌动球蛋白收缩力而导致细胞膜张力下降。

图1. 使用 Metamorph 创建新期刊的流程。

图 2. 自动图像处理流程的流程图。

图3. 去除单个细胞。

图 4. 构建参考细胞。

图 5. 细胞接种。A) 冲洗步骤后贴附于微图案上的Hela细胞（4倍放大） B) 在L型微图案上完全铺展后的HeLa细胞（10倍放大）。

图6. 对照和药物处理条件下，非图案化细胞与微图案化细胞的比较。HeLa细胞接种3小时后，用5 μM布比司汀处理1小时（下图）或不做处理（上图）。在对照组的非图案化细胞中（a），肌动蛋白组装成多条纤维，而在5 μM布比司汀处理后（d），这些纤维几乎完全解聚。在L形微图案上，对照组细胞呈现三角形形态（b），并在L形的两个顶点之间形成一条主要的肌动蛋白纤维（应力纤维）。与非图案化细胞（d）相比，布比司汀在L形微图案化细胞中诱导出显著的表型变化（e）。通过由20个细胞构建的“参考细胞”展示模式，可快速直观地观察药物效应，并比较对照组与处理组之间的差异。与单个细胞类似，对照组的参考细胞中可见一条清晰且强亮的应力纤维（c），而经布比司汀处理的细胞则发生塌陷，主要应力纤维消失（f）。

图7. 使用宏Hypothenuse分析blebbistatin对细胞作用的示例。在对照组细胞中，25%的细胞发生塌陷，而在5 μM blebbistatin处理的细胞中，塌陷比例增加至75%，为对照组的3倍，反映出肌动球蛋白收缩网络的减弱（n=50个细胞）。

讨论

微图形图案的选择

尽管5 μM 旋杯霉素在标准培养基质上的效应几乎无法察觉，但在能够将肌动蛋白集中形成单一主要应力纤维的微图案上，可实现有效的定量分析。这有助于增强对细胞骨架的可视化，从而准确量化旋杯霉素对细胞的作用。在实验设计中，微图案的形状选择至关重要，需根据研究所要突出的表型变化进行设计。

结论

微图案有助于可视化和量化药物效应，尤其是在低浓度条件下。在基于细胞的检测中，用黏附性微图案替代均质平面基底可提高所获得数据的准确性、灵敏度和质量。因此，为获得可靠的统计结果，所需用于分析的细胞数量更少³。黏附性微图案为改进功能研究以及在较低药物浓度下探索表型变化提供了切实可行的机会，从而避免诱发毒性或间接的药物效应。若采用适当的筛选平台，微图案可满足制药公司对改进基因/药物筛选应用的需求。以下引用了一些近期利用微图案分析和量化细胞现象的研究实例^3-13。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CYTOOchips 20x20 L-M-FN	CYTOO	10-114	CYTOOchips are available for adsorption of the protein of your choice
PBS 1x	GIBCO, by Life Technologies	14040-091
Counting chamber (Kova slide)	Prolabo	71287.01
DMEM/F-12 + Glutamax-I	GIBCO, by Life Technologies	25300-054
FBS (f tal bovine serum)	PAA Laboratories	31331-028
Penicillin & Streptomycin	PAA Laboratories	A15-101
6 wells-plate	Dutscher	353046
centrifuge	Fisher Scientific	M65838
Microscope	Nikon Instruments
Cytoskeleton Buffer 1X (CB)	Sigma-Aldrich	MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889	10 mM MES pH 6.1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
PFA 32 %	Electron Microscopy Sciences	15714
PFA 5%			Mix 10 mL of PFA 32% with 54 mL of CB 1.185X
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284
PBS tablets	GIBCO, by Life Technologies	18912-014
Bovin serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7806
Phallodin-FITC	Sigma-Aldrich	P5282
H–scht	Invitrogen	H3570
Blebbistatin	Euromedex	BN0640
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
NH4Cl 0.1M	Sigma-Aldrich	M11209
Epifluorescent microscope	Nikon Instruments	Eclipse Ti
CCD Camera	TBC	TBC
ImageJ Software	http://rsbweb.nih.gov/ij/