在本视频中，我们展示了利用荧光标记的蛋白激酶C（PKC）在活细胞中可视化PKC转位的过程。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白激酶C（PKCs）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在调控多种细胞过程（如细胞生长、学习与记忆）中发挥核心作用。在脊椎动物中已知存在四个PKC亚型家族：经典型PKC（α、βI、βII和γ）、新型I型PKC（ε和η）、新型II型PKC（δ和θ）以及非典型PKC（ζ和ι）。经典型PKC由Ca²⁺2+ 以及二酰基甘油（DAG），而新型PKC由DAG激活，但不依赖Ca2+-非依赖性。非典型PKCs不被Ca2+ 也不涉及DAG。在 Aplysia californica在我们用于研究记忆形成的模型系统中，神经系统特异性的蛋白激酶C（PKC）同工型共有三种，分别属于三个主要类别：即经典型PKC Apl I、新型I型PKC Apl II和非典型PKC Apl III。PKC是一类脂质激活的激酶，因此经典型和新型PKC在响应胞外信号时的活化通常伴随着其从细胞质向质膜的转位。因此，在活细胞中实时观察PKC的转位已成为阐明导致PKC活化的信号转导通路的不可或缺的工具。例如，该技术使我们得以证实，不同PKC同工型在不同条件下发生转位，从而介导不同类型的突触可塑性；并且5-羟色胺（5HT）对PKC Apl II的激活需要二酰甘油（DAG）和磷脂酸（PA）的共同生成才能实现转位。 1-2重要的是，能够反复观察同一个神经元使我们得以极其精细地测量PKC反应的脱敏过程 3在本视频中，我们演示制备Sf9细胞培养物的每一步操作，以及培养物的 Aplysia 感觉神经元已在另一篇视频文章中被描述 4，在Sf9细胞中表达荧光标记的PKCs以及在 Aplysia 感觉神经元及利用激光扫描显微镜对不同激活剂诱导的PKC转位进行活体成像。
方案
1. Sf9 细胞单层培养物的制备与维持
- Sf9 细胞的培养和维持在组织培养罩中进行。
- Sf9 细胞来源于 Spodoptera frugiperda 卵巢细胞（Sf21 细胞），可从 Invitrogen 公司购买以 Grace's 培养基冷冻保存的细胞。
- 在斜颈的 75 cm2 细胞培养瓶中加入 8 mL 补充了添加剂（1X）并添加了 30% 胎牛血清（FBS）的 Grace's 昆虫培养基。
- 将冻存的 Sf9 细胞管在 37°C 水浴中快速解冻，通过来回移动试管约 1–2 分钟完成。
- 将 Sf9 细胞转移至 75 cm2 细胞培养瓶中，并用手轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布。
- 在 27°C 下孵育 1–2 小时，直至细胞贴壁。
- 移除旧培养基，更换为 10 mL 新鲜的含 30% FBS 的 Grace's 昆虫培养基。
- 在 27°C 下孵育，直至细胞达到汇合状态。
- 为维持单层培养，从汇合的 Sf9 细胞培养瓶中移除旧培养基，并加入 5 mL 含 10% FBS 的 Grace's 昆虫培养基。
- 轻轻敲击培养瓶侧面数次，使 Sf9 细胞脱落。
- 使用 10 mL 移液器和移液器辅助装置，轻柔地将培养基上下吹打一次，在向下吹打时喷洒瓶壁。将细胞转移至无....
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讨论
我们描述了一种在Sf9细胞和Aplysia感觉神经元中实时成像荧光标记的蛋白激酶C（PKC）转位的技术。Sf9细胞为PKC转位的成像提供了一个简单的系统，因为其培养和转染操作相对直接。相比之下，Aplysia感觉神经元的显微注射需要较长时间才能掌握，可能长达数月。该技术相关的难点之一是电极堵塞。过滤注射溶液并进行离心通常有助于解决此问题，但有时在填充电极过程中会形成气泡。我们发现，使用微加样吸头而非依靠毛细作用来填充电极，有助于最大限度减少气泡的形成。关于活体成像，在成像过程中需严格控制两个因素：温度和运动。温度波动可能影响PKC的转位，因此应考虑使用温度控制腔室。为避免成像过程中的移动，可使用防震台。
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致谢
本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）向 Wayne S. Sossin 提供的资助。Carole A. Farah 获得了魁北克健康研究基金会（FRSQ）的博士后奖学金以及康拉德·哈灵顿（Conrad Harrington）奖学金。作者谨此感谢 Joanna Bougie、Margaret Hastings 和 Margaret Labban 在视频拍摄过程中提供的帮助，以及 Madeline Richmond Pool 在图形概览方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 冻存细胞 | 草地贪夜蛾 卵巢细胞 | Invitrogen | B825-01 | |
| 格蕾丝’补充昆虫培养基（1X），液体 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11605-094 | 用于培养Sf9细胞 |
| Corning 75 cm2 倾斜颈细胞培养瓶 | 工具 | 康宁 | 430720 | 用于培养Sf9细胞 |
| 胎牛血清 | 试剂 | CanSera | CS-C08-500 | 补充 Grace’使用前将含 FBS 的培养基 |
| 注射器 | 工具 | BD Biosciences | 309604 | 用于过滤快绿溶液 |
| 注射器 | 工具 | BD 生物科学 | 309602 | 用于过滤质粒 DNA / 快绿溶液 |
| 过滤 | 工具 | 康宁 | 431229 | 用于过滤快绿溶液 |
| 过滤 | 工具 | 康宁 | 431212 | 用于过滤质粒 DNA / 快绿溶液 |
| 玻璃底培养皿 | 工具 | MatTek 公司 | P35G-1.5-14-C | 用于转染和成像前培养Sf9细胞 |
| Cellfectin II 试剂 | 试剂 | Invitrogen | 10362-100 | 用于在Sf9细胞中表达荧光标记的PKC |
| 快绿 FCF | 试剂 | Sigma-Aldrich | F-7252 | 用于可视化质粒DNA溶液的显微注射过程 Aplysia 感觉神经元 |
| 薄壁玻璃毛细管 | 工具 | 世界精密仪器公司 | TW100F-4 | 用于制作微粒–用于显微注射的电极 |
| 微量移液器吸头 | 工具 | Eppendorf | CA32950-050 | 使用前需高压灭菌以填充微量移液器–用于显微注射的电极 |
| PV820 气动PicoPump | 工具 | 世界精密仪器公司 | SYS-PV820 | 显微注射工作站的一部分 |
| 显微镜–电极夹 holder | 工具 | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | 用于固定显微操作器械–电极 |
| 显微操作仪 | 工具 | Sutter Instrument Co. | MP-85 | 用于定位微操作器–三轴中的电极 |
参考文献
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein,
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