在本视频中，我们展示了利用荧光标记的蛋白激酶C（PKC）在活细胞中可视化PKC转位的过程。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白激酶C（PKCs）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在调控多种细胞过程（如细胞生长、学习与记忆）中发挥核心作用。在脊椎动物中已知存在四个PKC亚型家族：经典型PKC（α、βI、βII和γ）、新型I型PKC（ε和η）、新型II型PKC（δ和θ）以及非典型PKC（ζ和ι）。经典型PKC由Ca²⁺2+ 以及二酰基甘油（DAG），而新型PKC由DAG激活，但不依赖Ca2+-非依赖性。非典型PKCs不被Ca2+ 也不涉及DAG。在 Aplysia californica在我们用于研究记忆形成的模型系统中，神经系统特异性的蛋白激酶C（PKC）同工型共有三种，分别属于三个主要类别：即经典型PKC Apl I、新型I型PKC Apl II和非典型PKC Apl III。PKC是一类脂质激活的激酶，因此经典型和新型PKC在响应胞外信号时的活化通常伴随着其从细胞质向质膜的转位。因此，在活细胞中实时观察PKC的转位已成为阐明导致PKC活化的信号转导通路的不可或缺的工具。例如，该技术使我们得以证实，不同PKC同工型在不同条件下发生转位，从而介导不同类型的突触可塑性；并且5-羟色胺（5HT）对PKC Apl II的激活需要二酰甘油（DAG）和磷脂酸（PA）的共同生成才能实现转位。 1-2重要的是，能够反复观察同一个神经元使我们得以极其精细地测量PKC反应的脱敏过程 3在本视频中，我们演示制备Sf9细胞培养物的每一步操作，以及培养物的 Aplysia 感觉神经元已在另一篇视频文章中被描述 4，在Sf9细胞中表达荧光标记的PKCs以及在 Aplysia 感觉神经元及利用激光扫描显微镜对不同激活剂诱导的PKC转位进行活体成像。
方案
1. Sf9 细胞单层培养物的制备与维持
- Sf9 细胞的培养和维持在组织培养罩中进行。
- Sf9 细胞来源于 Spodoptera frugiperda 卵巢细胞（Sf21 细胞），可从 Invitrogen 公司购买以 Grace's 培养基冷冻保存的细胞。
- 在斜颈的 75 cm2 细胞培养瓶中加入 8 mL 补充了添加剂（1X）并添加了 30% 胎牛血清（FBS）的 Grace's 昆虫培养基。
- 将冻存的 Sf9 细胞管在 37°C 水浴中快速解冻，通过来回移动试管约 1–2 分钟完成。
- 将 Sf9 细胞转移至 75 cm2 细胞培养瓶中，并用手轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布。
- 在 27°C 下孵育 1–2 小时，直至细胞贴壁。
- 移除旧培养基，更换为 10 mL 新鲜的含 30% FBS 的 Grace's 昆虫培养基。
- 在 27°C 下孵育，直至细胞达到汇合状态。
- 为维持单层培养，从汇合的 Sf9 细胞培养瓶中移除旧培养基，并加入 5 mL 含 10% FBS 的 Grace's 昆虫培养基。
- 轻轻敲击培养瓶侧面数次，使 Sf9 细胞脱落。
- 使用 10 mL 移液器和移液器辅助装置，轻柔地将培养基上下吹打一次，在向下吹打时喷洒瓶壁。将细胞转移至无菌的 15 mL 聚苯乙烯管中。
- 在新的 75 cm2 细胞培养瓶中，将 2 mL Sf9 细胞悬液加入 8 mL 含 10% FBS 的 Grace's 昆虫培养基中（1:5 稀释以维持对数生长期），并用手轻轻摇晃培养瓶。
- 在 27°C 下孵育，直至细胞达到汇合状态。
2. 在Sf9细胞中表达荧光标记的PKC
- 进行活细胞成像实验时，将 Sf9 细胞培养在 35 mm MatTek 玻璃底培养皿中，玻璃区域直径为 14 mm，盖玻片厚度为 0.16 至 0.19 mm。
- 使用 Cellfectin II 转染试剂，按照制造商推荐方法并结合下述修改条件，在 Sf9 细胞中表达荧光蛋白标记的 PKC。
- 第 1 天：接种细胞前，用含 10% 胎牛血清（FBS）的 Grace 昆虫培养基处理每个 MatTek 培养皿，处理时间至少 30 分钟。
- 使用血细胞计数板对步骤 11（上文）中的 Sf9 细胞进行计数。
- 在每个 MatTek 玻璃盖玻片上接种 0.05 × 106 个细胞，总体积为 150 μL。室温下孵育 30 分钟，使细胞贴壁。
- 逐次缓慢向每个培养皿中加入 2 mL 含 10% FBS 的 Grace 培养基，每次加入 1 mL，避免细胞脱落。
- 在 27°C 下过夜孵育。
- 此后步骤请遵循制造商关于使用质粒 DNA 转染 Sf9 细胞的推荐方案。
- 第 2 天：使用 Cellfectin II 转染试剂将荧光标记的 PKC 转染至 Sf9 细胞中。在此系统中，我们常共表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记和单体红色荧光蛋白（mRFP）标记的 PKC（质粒构建细节此前已有描述2,5）。单个荧光蛋白表达时，转染后 72 小时约有 70–80% 的细胞表达目标蛋白；共表达两种荧光蛋白时，共表达细胞的比例下降至约 30%。当共表达 eGFP 标记和 mRFP 标记的 PKC 时，为获得最佳蛋白表达水平，mRFP 标记蛋白所用质粒 DNA 量应为 eGFP 的两倍。
- 转染后 48–72 小时进行活细胞成像（为获得最佳蛋白表达，建议等待 72 小时）。
3. 在Aplysia感觉神经元中表达荧光标记的PKC
- 关于 Aplysia 神经元细胞培养的制备方法已在 Zhao 及其同事发表的视频文章中有所描述4。
- 使用下文详述的显微注射方法，将带有荧光蛋白标记的 PKC 表达于 Aplysia 感觉神经元中。
- 用蒸馏水配制 1% 的亮蓝 FCF（Fast Green）储备液，并使用注射器和 28 mm 注射器滤器（0.20 μm）过滤。分装后于 -20°C 保存。
- 可在分离神经元后的第 1 天或第 2 天进行感觉神经元的显微注射，但我们发现等待 2 天有助于细胞更好地贴附于盖玻片。
- 在分离感觉神经元后的第 2 天，解冻一份亮蓝 FCF 储备液，并再次使用注射器和 28 mm 注射器滤器（0.20 μm）过滤。
- 用蒸馏水配制含有 0.5% 亮蓝 FCF 的质粒 DNA 溶液。质粒 DNA 浓度最高可使用至 0.4 μg/μL，但不建议超过此浓度。
- 使用 1 mL 注射器和 4 mm 注射器滤器（0.20 μm）过滤质粒 DNA / 亮蓝 FCF 溶液。
- 将质粒 DNA / 亮蓝 FCF 溶液在微量离心机中以 16110 × g 离心 15 分钟。
- 使用微电极拉制仪（Sutter Flaming/Brown 微移液管拉制仪，型号 P-97）拉制用于神经元显微注射的尖锐电极。使用盒式灯丝，采用内含细丝的薄壁玻璃毛细管（World Precision Instruments TW100F-4，外径 1 mm，内径 0.75 mm，长度 100 mm）拉制玻璃微电极。有关微注射电极拉制的更多细节，请参阅 Sutter 电极制作手册。
- 使用微加样器吸头（eppendorf CA32950-050）向每根电极中加入 2 μL 质粒 DNA / 亮蓝 FCF 溶液。
- 将含有 Aplysia 神经元培养物的 MatTek 玻底培养皿转移至显微注射工作站。
- 显微注射工作站包括以下组件：一个自制的大型玻璃载物台，用于将培养皿置于隔振台（Kinetic Systems 隔振工作站）上；配备外部卤素光源的体视显微镜；三轴可调的微操纵器（Sutter Huxley Wall 型微操纵器，支持粗调和超精细定位）；连接至气动泵（World Precision Instruments PV820 气动皮升泵）的微电极夹持器。气动泵的压力输入端连接至压缩氮气罐。
- 将微电极插入微电极夹持器中。
- 在体视显微镜下观察，将微量移液管的尖端插入细胞核内。
- 施加短暂的氮气压力脉冲（持续时间为 10 至 100 毫秒，压力为 20 lb/in2），直至细胞核呈现均匀绿色。
- 将细胞在室温下孵育 4 小时，随后置于 4°C 保存直至使用。为获得最佳的 PKC 易位效果，建议在注射后 20 至 24 小时内进行活细胞成像实验。
4. 在活体Sf9细胞及Aplysia感觉神经元中观察PKC的转位
- 成像时，我们使用配备 Axiovert 200 的蔡司 LSM510 倒置共聚焦显微镜。
- Sf9 细胞与 Aplysia 感觉神经元的成像方案相同，仅以下参数不同：Sf9 细胞使用 63 倍油镜进行成像，而 Aplysia 感觉神经元使用 40 倍油镜进行成像；Sf9 细胞在温度控制的培养室中成像，温度维持在 26–27oC，而 Aplysia 感觉神经元则在室温下成像，温度维持在约 18–20oC。
- 我们使用 30 mW 氩离子激光器（激发波长 488 nm），激光输出功率设为 50%，用于成像 eGFP 标记的 PKC 蛋白；使用 HeNe 激光器（激发波长 543 nm）用于成像 mRFP 标记的 PKC 蛋白。在成像前，氩离子和 HeNe 激光线的透射输出分别衰减至 4% 和 50%，并调节针孔至 1。
- 必须将培养皿稳定放置于成像载物台上，避免移动或振动。
- 使用 10 mL 移液器轻柔地从培养皿中移除 1 mL 培养基，使皿中剩余总体积为 1 mL。
- 在细胞中部区域拍摄图像，以便观察到细胞核。
- 设置时间序列，采集 10–20 幅共聚焦图像，每 30 秒拍摄一幅。
- 开始时间序列采集。
- 在拍摄完前两幅图像（即 30 秒时间点后），使用 P1000 移液器将 1 mL 药物（2 倍浓度）逐滴轻柔地加至细胞表面。药物添加过程持续约 30 秒。
- 某些药物可诱导快速转位，可在给药后立即观察到（60 秒时间点）；而另一些药物则诱导缓慢转位，最佳观察时间为给药后 5–10 分钟（Movie 1 和 Movie 2）。
- 若需洗去药物，使用两个 10 mL 移液器进行清洗：用一支移液器从培养皿一侧轻柔地加入清洗缓冲液，同时用另一支从对侧吸出培养基。
- 若清洗有效且药物作用可逆，则 PKC 可在 30–60 秒内重新回到胞质中。
- 将视频保存为 LSM 文件格式。
- 使用 NIH Image J 软件打开 LSM 文件，并对给药前和给药后的图像进行定量分析。定量方法已在其他文献中描述1。
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讨论
我们描述了一种在Sf9细胞和Aplysia感觉神经元中实时成像荧光标记的蛋白激酶C（PKC）转位的技术。Sf9细胞为PKC转位的成像提供了一个简单的系统，因为其培养和转染操作相对直接。相比之下，Aplysia感觉神经元的显微注射需要较长时间才能掌握，可能长达数月。该技术相关的难点之一是电极堵塞。过滤注射溶液并进行离心通常有助于解决此问题，但有时在填充电极过程中会形成气泡。我们发现，使用微加样吸头而非依靠毛细作用来填充电极，有助于最大限度减少气泡的形成。关于活体成像，在成像过程中需严格控制两个因素：温度和运动。温度波动可能影响PKC的转位，因此应考虑使用温度控制腔室。为避免成像过程中的移动，可使用防震台。
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致谢
本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）向 Wayne S. Sossin 提供的资助。Carole A. Farah 获得了魁北克健康研究基金会（FRSQ）的博士后奖学金以及康拉德·哈灵顿（Conrad Harrington）奖学金。作者谨此感谢 Joanna Bougie、Margaret Hastings 和 Margaret Labban 在视频拍摄过程中提供的帮助，以及 Madeline Richmond Pool 在图形概览方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 冻存细胞 | 草地贪夜蛾 卵巢细胞 | Invitrogen | B825-01 | |
| 格蕾丝’补充昆虫培养基（1X），液体 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11605-094 | 用于培养Sf9细胞 |
| Corning 75 cm2 倾斜颈细胞培养瓶 | 工具 | 康宁 | 430720 | 用于培养Sf9细胞 |
| 胎牛血清 | 试剂 | CanSera | CS-C08-500 | 补充 Grace’使用前将含 FBS 的培养基 |
| 注射器 | 工具 | BD Biosciences | 309604 | 用于过滤快绿溶液 |
| 注射器 | 工具 | BD 生物科学 | 309602 | 用于过滤质粒 DNA / 快绿溶液 |
| 过滤 | 工具 | 康宁 | 431229 | 用于过滤快绿溶液 |
| 过滤 | 工具 | 康宁 | 431212 | 用于过滤质粒 DNA / 快绿溶液 |
| 玻璃底培养皿 | 工具 | MatTek 公司 | P35G-1.5-14-C | 用于转染和成像前培养Sf9细胞 |
| Cellfectin II 试剂 | 试剂 | Invitrogen | 10362-100 | 用于在Sf9细胞中表达荧光标记的PKC |
| 快绿 FCF | 试剂 | Sigma-Aldrich | F-7252 | 用于可视化质粒DNA溶液的显微注射过程 Aplysia 感觉神经元 |
| 薄壁玻璃毛细管 | 工具 | 世界精密仪器公司 | TW100F-4 | 用于制作微粒–用于显微注射的电极 |
| 微量移液器吸头 | 工具 | Eppendorf | CA32950-050 | 使用前需高压灭菌以填充微量移液器–用于显微注射的电极 |
| PV820 气动PicoPump | 工具 | 世界精密仪器公司 | SYS-PV820 | 显微注射工作站的一部分 |
| 显微镜–电极夹 holder | 工具 | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | 用于固定显微操作器械–电极 |
| 显微操作仪 | 工具 | Sutter Instrument Co. | MP-85 | 用于定位微操作器–三轴中的电极 |
参考文献
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
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