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一种基于微流控的单颗粒流体动力学捕获装置

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DOI：

10.3791/2517

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2011年1月21日

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1Center for Biophysics and Computational Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于流体动力学流动的微流控粒子束缚方法。我们通过反馈控制机制，在流体停滞点实现了粒子的稳定捕获，从而能够在集成化的微流控器件中对任意粒子进行束缚和微操控。

摘要

在自由溶液中实现对单个粒子的限制与操控，是推动基础科学与应用科学发展的关键技术。基于光学、磁学、电动力学和声学技术的粒子捕获方法，已在从分子到细胞水平的物理学和生物学领域取得重大进展。本文介绍一种全新的、完全基于流体动力学流动的微流控粒子捕获与操控技术。利用该方法，我们实现了在水溶液中对微米及纳米尺度粒子的长期捕获。该流体动力学捕获装置由集成式微流控芯片构成，其通道结构为交叉槽设计，两股相对的层流在此交汇，从而产生具有流体停滞点（零速度点）的平面拉伸流动。在此装置中，通过主动调控流场以维持粒子位于流体停滞点，从而实现对粒子在捕获中心的有效限制。通过定制开发的 LabVIEW 程序实现反馈控制算法，可在自由溶液中高效地捕获粒子。该控制算法包括：获取微流控装置中粒子的图像，随后进行粒子追踪、确定粒子质心位置，并通过压力调节器调节施加于芯片上气动阀的压力，从而主动调节流体流动。通过这种方式，芯片上的动态计量阀可调节出口通道中的相对流速，进而实现对停滞点位置和粒子捕获的精细控制。基于微流控的流体动力学捕获技术在粒子捕获方面具有多项优势。该方法适用于任意类型的粒子，对被捕获物体的物理或化学性质无特殊要求。此外，在高浓度或拥挤的粒子悬浮液中，流体动力学捕获仍可实现对“单个”目标粒子的限制，而这一点在其他基于力场的捕获方法中难以实现。该流体动力学捕获装置操作简便、易于实施，可集成至现有的微流控系统中，便于实现粒子的捕获与长期分析。总体而言，流体动力学捕获为无需表面固定的粒子限制、微操控与观察提供了一个全新平台，同时避免了在自由溶液中捕获小粒子时可能带来干扰的光学、磁学和电场的使用。

方案

流体动力阱由一种双层杂化（聚二甲基硅氧烷（PDMS）/玻璃）微流控装置构成，用于颗粒的限域。步骤1-2描述了微流控装置的制备，步骤3-4讨论了装置的设计与操作。

1. SU-8 模具制备（视频中未展示）

  1. 用丙酮和异丙醇（IPA）清洁两片硅片（直径 3 英寸）。
  2. 用 N2 吹干硅片，并将其置于 65°C 的加热板上 1 分钟，以去除残留水分。
  3. 在硅片 #1 上旋涂 SU-8 2050 光刻胶（PR），转速 4000 rpm，持续 30 秒，以制备厚度约为 40 μm 的流体层模具；在硅片 #2 上旋涂光刻胶，转速 1500 rpm，持续 30 秒，以制备厚度约为 150 μm 的控制层模具。
  4. 将硅片 #1 在 65°C 下预烘 3 分钟，然后在 95°C 下预烘 6 分钟；将硅片 #2 在 65°C 下预烘 5 分钟，然后在 95°C 下预烘 20 分钟。
  5. 使用相应的掩膜版（硅片 #1：进样口和流体通道；硅片 #2：进样口和控制层）对硅片进行紫外光曝光，并采用适当的曝光强度（分别为约 150 mJ/cm2 和约 260 mJ/cm2）。
  6. 将硅片 #1 在 65°C 下后烘 1 分钟，然后在 95°C 下后烘 6 分钟；将硅片 #2 在 65°C 下后烘 5 分钟，然后在 95°C 下后烘 10 分钟。
  7. 用丙二醇甲醚醋酸酯（PGMEA）显影硅片，直至未曝光的光刻胶被完全去除。用 IPA 冲洗硅片，并用 N2 吹干。

2. 微流控装置的制备

  1. 将晶圆置于含有数滴三氯硅烷的玻璃培养皿中，并放入真空干燥器内约10分钟，以对SU-8模具表面进行硅烷化处理。表面硅烷化有助于将聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制品从SU-8模具上顺利剥离。
  2. 分别按照15:1和5:1的基础剂与交联剂比例混合并脱气PDMS，用于流体层和控制层。
  3. 将15:1的PDMS混合物在750 rpm转速下旋涂于流体层模具（晶圆#1）上，持续30秒，然后将晶圆放入培养皿中。将控制层模具也放入另一培养皿中，并将5:1的PDMS混合物浇注其上，厚度约为4 mm。
  4. 在70°C下烘烤晶圆/PDMS 30分钟，使PDMS层部分固化。
  5. 待晶圆/PDMS冷却至室温后，用手术刀从培养皿中切割并从SU-8模具上剥离出形成控制层的PDMS复制品（晶圆#2）。使用21号针头在微通道处打孔，作为芯片上膜阀的接入端口。
  6. 将带有控制层的PDMS复制品放置在晶圆#1（已旋涂PDMS流体层）上。在体视显微镜下仔细对齐，并将控制层与流体层密封。确保各层之间无任何气泡，并在70°C下烘烤过夜，以完全固化两层。此烘烤步骤将形成具有两层结构的一体化PDMS块。
  7. 冷却至室温后，使用手术刀切割并从SU-8模具上剥离包含控制层和流体层的PDMS复制品。去除多余的PDMS，并用剃刀片分离各个装置单元。使用21号针头在流体层的微通道上打孔，作为接入端口。
  8. 将PDMS块键合到盖玻片上以获得完整的装置。首先，用丙酮和异丙醇（IPA）清洗盖玻片（No: 1.5，24 × 45 mm）。然后，在500 mTorr条件下对盖玻片和PDMS复制品表面进行30秒的氧气等离子体处理，并立即使两表面接触，形成不可逆密封。
  9. 将装置烘烤过夜，以增强PDMS层与盖玻片之间的键合强度。

步骤3-4描述了使用上述微流控装置实现流体动力学捕获的方法。

3. 流体动力阱实验装置

  1. 将微流控装置放置在倒置显微镜的载物台上，并用载物台夹固定。
  2. 分别用缓冲液和样品溶液填充两个气密性注射器，并将其安装在哈佛仪器（Harvard Apparatus）的注射泵（PHD 2000 可编程型）上。缓冲液和样品溶液分别通过 1 ml 和 250 μl 的注射器输送至微流控装置。通常使用含有 0.02% v/v Triton X-100 的 50 mM Tris/Tris HCl 缓冲液（pH 8.0）作为缓冲溶液。样品溶液由悬浮在缓冲液中的颗粒（例如荧光聚苯乙烯微球）组成。
  3. 建立连接注射器（输送样品和缓冲液）与微流控装置之间的流体通路。使用鲁尔锁接头将注射器连接至外径（OD）1/16"、内径（ID）0.020" 的全氟烷氧基（PFA）管路。再通过 24 号金属管将 PFA 管路的另一端连接至微流控装置的进样口。可在样品注射器与微流控装置的样品进样口之间安装一个 T 型阀，以控制样品的输送。
  4. 建立微流控装置出口通道的流体连接。使用 24 号金属管将两个出口通道连接至外径（OD）1/16"、内径（ID）0.020" 的 PFA 管路。出口端的 PFA 管路应保持等长。将两根出口管路末端浸入装有缓冲液的 1.5 mL 离心管中，以维持注射器与出口通道之间的恒定压降。
  5. 使用 3 mL 鲁尔锁塑料注射器向芯片上的阀门中注入氟化载油，以防止操作过程中空气渗入流体层。阀室中的空气将通过 PDMS 膜被推入流体层的微通道中，并随后随流体流动经出口通道从装置中排出。
  6. 将加压惰性气体（氮气）源连接至控制层的端口，以驱动芯片上的阀门。本实验中使用压力为 2200 psi 的氮气瓶和电子压力调节器，向微流控装置中的片上阀门提供 0–30 psi 的压力。氮气瓶通过外径（OD）¼"、内径（ID）0.170" 的管路连接至压力调节器，压力调节器则通过外径（OD）1/16"、内径（ID）0.020" 的 PFA 管路连接至微流控装置，末端使用 24 号金属管进行连接。
  7. 用 0.5 mL 缓冲液冲洗流体通路和微流控装置，确保系统中（包括出口通道）的所有气泡均被清除。用于排除气泡的典型流速范围为 2000–5000 μL/hr。当微流控通道中的气泡完全清除后，将流速降低至 50–100 μL/hr，此为颗粒捕获的典型体积流速。
  8. 此时，流体通路已建立，样品和缓冲液以恒定流速（50–100 μL/hr）输送至微流控装置，装置已准备就绪，可进行流体动力学捕获操作。

4. 流体动力学捕获步骤

  1. 运行定制的 LabVIEW 程序，该程序可自动完成颗粒捕获（参见下方关于 LabVIEW 程序的使用说明）。
  2. 使用显微镜的 x-y 平移载物台，将捕获区域（十字槽）置于相机视野中心。调节物镜焦距使捕获区域清晰成像，并调整相机设置以优化成像条件。
  3. 在相机视野内选择一个矩形兴趣区域（ROI），使该区域的中心即为捕获点的位置。
  4. 初始化施加在芯片阀上的偏置压力。在其中一个出口通道中引入宽度为 100–200 μm 的收缩结构，以提供芯片阀的偏置压力。恒定的偏置压力可使芯片阀调节滞止点位置，使其位于通道十字槽中心附近。对于大多数实验，偏置压力设定在 0–12 psi 之间，具体数值取决于通道尺寸（高度和宽度）、收缩段宽度以及芯片阀的规格（阀尺寸、膜厚度等）。
  5. 启动反馈控制器，并调节比例增益以优化捕获响应。反馈控制器将调节施加在芯片阀上的压力，从而移动滞止点位置，以最小化颗粒位置与设定点（捕获中心）之间的误差或距离。根据流速和芯片阀位置的不同，存在一个最优的比例增益值，可提高捕获稳定性并消除颗粒不必要的振荡。
  6. 捕获颗粒。LabVIEW 程序将自动捕获进入捕获区域的颗粒之一。一旦目标颗粒被捕获，可根据需要关闭样品流，将被捕获的颗粒隔离在缓冲溶液中。
  7. 监测被捕获的颗粒，并通过手动调焦或自动对焦显微镜系统保持颗粒在成像平面内的清晰聚焦。在长时间捕获过程（数分钟至数小时）中，可能需要轻微调整反馈控制器的比例增益，以确保捕获稳定性。

LabVIEW 代码：反馈控制器使用说明

使用自定义的 LabVIEW 代码实现的线性反馈控制算法，可实现自动化的颗粒捕获。该 LabVIEW 代码从 CCD 相机获取图像，并向压力调节器发送电信号（电压），从而主动调节芯片上动态气动阀的位置（部分开启/关闭状态）。随着阀门位置的变化，一条出口通道中的流体动力学流速被调节，进而重新定位滞止点，实现流体动力学捕获。反馈回路中的各个步骤以图像采集速率（10–60 Hz）依次并循环执行。在每次反馈回路周期中，LabVIEW 代码执行以下步骤：

  • 图像采集。 使用10倍物镜（数值孔径：0.4）和CCD相机，通过荧光显微镜获取微流控装置捕获区域内“目标”粒子的图像。
  • 粒子追踪。 确定粒子的质心位置，并启动粒子追踪算法。通过将粒子的发射光强度分布拟合到点扩散函数（PSF），从而确定粒子的位置及其质心坐标。
  • 流场控制。 利用带有比例控制器的反馈控制算法，计算出施加于芯片上动态阀门的更新压力。通过这种方式，阀门的动作可重新定位停滞点，从而对粒子施加流体动力，引导粒子向捕获中心移动。

LabVIEW 代码会记录粒子捕获过程中每幅图像的以下数据：1）经过的时间，2）被捕获粒子的质心（x，y）位置，3）捕获光阱中心的位置，4）粒子与光阱中心之间的距离，5）施加到芯片阀门上的压力。此外，该代码还会以 AVI 文件格式记录被捕获粒子的视频。

5. 代表性结果

我们使用流体动力阱捕获了不同尺寸（直径为100、540、830 nm和2.2 μm）的荧光聚苯乙烯微球。图1(a)显示了在微流控装置的十字槽结处被捕获粒子的图像。被捕获粒子的轨迹可通过LabVIEW程序在捕获过程中记录的质心位置数据直接确定，或通过分析录制的视频文件中被捕获粒子的追踪与定位获得。图1(b)展示了被捕获粒子（直径为2.2 μm的荧光聚苯乙烯微球）沿出口通道方向的运动轨迹。该微球最初被捕获（方块标记）3分钟，随后从阱中释放，并沿其中一个出口通道逃逸（圆形标记）。沿压缩流轴方向（即入口通道方向；数据未显示）的粒子轨迹与沿拉伸流轴方向（即流出方向）的轨迹相似，如图1(b)所示。图1(c)显示了沿出口通道方向，直径为2.2 μm的被捕获微球相对于阱中心位移的直方图。利用本文所述的反馈控制算法，被捕获的粒子在入口和出口通道方向上被限制在阱中心±1 μm范围内。

用于流体动力学捕获的微流控装置示意图如图2所示。该集成式微流控装置由流体层和控制层组成，采用本文所述的标准多层软光刻技术制备。流体层包含缓冲液通道、样品通道以及用于实现流体动力学捕获的十字槽道结构。控制层包含一个位于流体层某一出口通道上方的气动阀，控制层与流体层之间由一层薄的弹性膜隔开。在装置运行过程中，向控制层的阀门通入氮气加压，使薄膜压入流体层，从而在出口通道中形成收缩。通过调节施加于控制层的压力大小，动态气动阀可实现出口通道不同程度的收缩，进而调节各出口通道中的相对流速，实现对滞留点的精细控制。

figure-protocol-1
图1：颗粒捕获。（a） 单个微珠在流体动力阱中被限制的图像。除位于捕获阱中心的微珠外，捕获区域内还显示了多个未被捕获的微珠。（b） 被捕获颗粒沿出口通道的运动轨迹（方块）。当颗粒从捕获阱中释放时（箭头），它将沿其中一个出口通道逃逸（圆圈）。（c） 被捕获微珠（直径2.2 μm）沿出口通道方向相对于捕获阱中心位移的直方图。

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图2：用于流体动力学捕获的微流控装置示意图。 流体动力学捕获装置采用双层微流控结构构建。流体层包含一个样品入口、四个缓冲液入口和两个废液出口。控制层包含一个气动膜阀，位于流体层中其中一个出口通道的上方。在相对的出口通道中设置一个收缩结构，为气动阀提供偏置压力。典型的通道尺寸范围为100–500 μm。在区域（A）中，样品入口被两个缓冲液入口进行流体聚焦。在区域（B）中，相对的流入流在十字交叉结处汇聚，实现捕获。气动阀（C）位于其中一个出口通道的上方，通过调节该阀的压力可调控滞留点的位置。

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讨论

基于流体动力流的现有微流控粒子操控方法可分为接触式和非接触式方法。接触式方法利用流体流动将粒子物理性地限制并固定在微加工通道壁上9，而非接触式方法则依赖循环流动或微涡流10。在本研究中，我们提出一种仅依靠流体流动作用实现溶液中自由粒子捕获的方法。该流体动力捕获技术可在微流控十字槽装置中的流体停滞点处实现对微小粒子的限制与操控。在此装置中，通过自动化反馈控制机制，对流动流体中停滞点的位置进行精细且主动的调节，从而实现粒子的稳定捕获。

流体动力阱对粒子的束缚紧密程度如何？又该如何优化？将粒子精确束缚在阱中心的准确性，取决于定位粒子位置时质心确定的精度。为了实现稳定的粒子捕获，用户应确保粒子与背景之间具有最大的图像对比度，以实现最佳的追踪和定位效果。此外，应特别注意避免微通道中存在气泡或碎屑，这些因素可能影响粒子的追踪。应使用稳定的流体源以尽量减少流体流动中的扰动，因为停滞点位置的稳定性对流动波动非常敏感。采用这种方法，测得对于约2 μm的粒子，流体动力阱的刚度约为~1E-4 pN/nm1，与电动力阱或光镊等其他方法相当...

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致谢

感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的 Kenis 团队提供了有益的讨论以及洁净室设施的使用权限。

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）独立研究者发展路径奖资助，资助号为4R00HG004183-03（Charles M. Schroeder 和 Melikhan Tanyeri）。

本工作得到了美国国家科学基金会向 Eric M. Johnson-Chavarria 提供的研究生研究奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
21号钝头针ZephyrtronicsZT-5-021-1-L用于在PDMS中打孔
3 ml塑料注射器BD Biosciences309585用于向阀中注入油
硅晶圆University Wafer3” P(100)单面抛光 380 μm测试级
盖玻片VWR international48404-42824 x 40 mm #1.5
数据采集卡National InstrumentsPCI 6229
荧光微球Spherotech, Inc.FP-2056-22.2 μm尼罗红标记
氟化液3MFC 40氟化载油
倒置显微镜Olympus CorporationIX-71
LabVIEWNational Instruments版本 9.0f3 (32位)
体视显微镜Leica MicrosystemsMZ6用于对齐PDMS控制层与流体层
机械对流烘箱VWR international1300U用于烘烤器件，形成双层一体式PDMS块
微流控管路与接头Upchurch Scientific1/16 x 0.020英寸PFA管路及超无法兰接头
PDMSGE HealthcareRTV 615 A&B
等离子体腔室Harrick Scientific Products, Inc.PDC-001
压力传感器Proportion AirDQPV1
旋涂仪Specialty Coating SystemsG3P-8 Spin Coat
光刻胶MicroChem Corp.SU 8 2050
注射泵Harvard ApparatusPHD 2000 可编程型
接线端子板National InstrumentsBNC 2110用于向压力调节器输出模拟信号并读取数据
紫外准直光源与曝光系统OAIModel 30 增强型光源

参考文献

  1. Tanyeri, M., Johnson-Chavarria, E. M., Schroeder, C. M. Hydrodynamic Trap for Single Particles and Cells. Applied Physics Letters. 96, 224101-224101 (2010).
  2. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Optics Letters. 11, 288-290 (1986).
  3. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
  4. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: Micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  5. Chiou, P. Y., Ohta, A. T., Wu, M. C., C, M. Massively parallel manipulation of single cells and microparticles using optical images. Nature. 436, 370-372 (2005).
  6. Cohen, A. E., Moerner, W. E. Method for trapping and manipulating nanoscale objects in solution. Applied Physics Letters. 86, 093109-09 (2005).
  7. Evander, M. Noninvasive acoustic cell trapping in a microfluidic perfusion system for online bioassays", Analytical Chemistry 79. , 2984-2991 (2007).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  9. Kim, M. C., Wang, Z. H., Lam, R. H. W., Thorsen, T. Building a better cell trap: Applying Lagrangian modeling to the design of microfluidic devices for cell biology. Journal of Applied Physics. 103, (2008).
  10. Lutz, B. R., Chen, J., Schwartz, D. T. Hydrodynamic tweezers: 1. Noncontact trapping of single cells using steady streaming microeddies. Analytical Chemistry. 78, 5429-5435 (2006).

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LabVIEW

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