通过导管插入、局部烧灼以及随后将癌细胞黏附至灼伤部位，可在雌性小鼠体内以微创方式建立膀胱肿瘤模型。
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本文内容
摘要
摘要
在此简便的操作过程中，通过导管插入、局部烧灼以及后续的细胞黏附，在雌性C57小鼠体内建立膀胱肿瘤模型。首先对小鼠进行经尿道导管插入并排空膀胱，随后再次插入导管，以便将铂金丝置入膀胱内，同时避免损伤尿道或膀胱。导管由聚四氟乙烯（Teflon）制成，可作为导线的绝缘层，使电流通过导线导入膀胱，造成局部烧伤。使用电灼装置向导线暴露端输送2.5 W功率，烧除膀胱壁的细胞外层，从而为后续经导管注入悬浮状态的癌细胞提供附着位点。细胞在膀胱内保留90分钟后，移除导管，使膀胱自然排空。通过超声成像监测肿瘤的形成过程。配套视频中特别详细展示了导管插入技术的操作要点。
方案
1. 动物
- 雌性 C57BL/6J 小鼠（Mus musculus）在发货前经供应商检测确认无传染性外寄生虫、蠕虫内寄生虫以及17种小鼠病毒的抗体。小鼠饲养于杜兰大学经AAALAC认证的动物实验设施中，遵循 实验动物护理和使用指南.1
- 小鼠以每笼4-5只的密度群养于带有硬木垫料的独立通气聚碳酸酯笼具中，笼顶配有微隔离滤膜。自由提供颗粒状啮齿类动物饲料和自来水。
- 小鼠在研究开始前需适应环境7天。
2. 细胞
- 使用小鼠移行细胞癌细胞系 MB49 制备膀胱肿瘤。
- 细胞在添加了 10% 胎牛血清、100 单位/毫升青霉素和 100 单位/毫升链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养。
- 培养物在 37°C 和 5% CO2 条件下维持，每两到三天更换一次培养基。
3. 动物原位肿瘤模型
本文所述的膀胱肿瘤模型灌注方法是对 Gunther 等人2所描述步骤的改进。
- 使用2%异氟烷（MWI/VetOne，Meridian，ID，货号# 501017）与氧气混合诱导麻醉，并以0.75-1.25%浓度维持麻醉。（可同时处理多只动物，此时需提高异氟烷浓度。）为防止角膜干燥，应用人工泪液眼膏润滑眼睛。使用加热垫置于纸单下以维持体温。
- 剪除下背部毛发以促进与金属接地板的接触，并在剃毛区域涂抹导电凝胶。
- 将每只小鼠单独仰卧置于金属接地板上，使用已移除针芯的润滑型24号、3/4英寸套管针经尿道插入导管，进行膀胱插管。
- 排空膀胱内尿液后，将一根铂金丝经导管插入膀胱，使导管两端均露出导线——导管腔内端露出约2 mm。选用铂金丝是因为该材料具有抗氧化特性。
- 随后通过电凝装置接触导线外露部分，向膀胱施加2.5 W电流，持续约0.5秒。
- 将导线移至膀胱内另一位置，并再次施加2.5 W电荷。
- 取出导线后，用1 ml注射器将100 μl浓度为1×106 个细胞/ml的MB49细胞悬液经导管注入膀胱。
- 注射器保持连接在导管上，以防止细胞悬液外流；插管小鼠继续维持麻醉状态90分钟，以使细胞充分附着于灼伤部位。
- 恢复前，每只小鼠经腹腔注射100-200 μl无菌生理盐水。
- 孵育期结束后移除导管，动物留在加热垫上恢复，直至翻正反射恢复，随后将小鼠放回原饲养笼中。
4. 超声
- 在对小鼠进行膀胱超声检查以监测肿瘤生长之前，需让肿瘤生长 3-5 天。
- 首次超声检查时，按上述方法对动物进行麻醉。将小鼠置于仰卧位，并通过剪除腹部毛发来准备皮肤。
- 将一根 24 号静脉留置针经尿道插入膀胱。此时可引流膀胱并收集尿液以进行进一步分析。
- 通过留置针向膀胱内注入 100 μl 无菌生理盐水，以提高超声下膀胱的可见度。
- 在腹部涂抹超声耦合剂，然后进行超声检查，评估膀胱壁和膀胱腔的情况。
5. 代表性结果：
接种后3-5天开始出现肿瘤组织。根据我们的经验，在12只小鼠的实验组中，通常有50%或更多的小鼠在第5天时可在膀胱内检测到组织肿块（体积为0.5 - 1.0 μl，采用公式 V=π/6·L·W·H 计算）。使用MB 49细胞时，肿瘤将持续生长，若不进行治疗，小鼠通常在第24天需要实施安乐死。当小鼠出现嗜睡或恶病质、毛发竖立、弓背、无反应行为，或体重减轻超过初始体重的20%时，建议实施安乐死。
肿瘤生长迅速，当质量达到200 mg或以上时，会出现坏死中心3，这显然是因为发育中肿瘤的细胞增殖速度超过了血管新生所能提供的血液供应能力。还可以通过血尿的程度间接监测肿瘤的进展，这可能与肿瘤内快速的血管新生有关。 consistently 观察到，未治疗的荷瘤小鼠在接种后第14天尿液中即含有血液。这些小鼠尿液中红细胞浓度随时间推移而增加，且收集到的尿液体积减少。超过50 mg的肿瘤通常在接种后14天左右即可相对容易地触及。
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讨论
这种在雌性小鼠中建立原位膀胱肿瘤的微创方法也可用于MB49以外的其他细胞类型，但应预期结果可能有所不同。当使用侵袭性较低的肿瘤细胞时，可略微增加功率（以0.5 W为增量确定新的最佳功率），从而产生更利于肿瘤细胞附着的区域；同时延长灌注细胞在膀胱内的孵育时间，将增加细胞在灼伤部位的附着量（未发表数据）。尽管某些方案建议使用10 W的电灼功率2，但该功率应视为上限，甚至应完全避免使用。当使用其他细胞类型时，增加接种细胞的浓度也可提高成功率。
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披露
动物实验严格按照杜兰大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。
致谢
本工作由美国国家科学基金会职业奖（CBET-0846395）和杜兰大学比较医学系资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | 3-5 周龄 |
| 聚碳酸酯笼具及通风笼架 | Lab Products | Super Mouse 750 | 327 mm x 190 mm x 143 mm |
| 硬木垫料 | Harlan 实验室 | 实验室–级 SaniChips | |
| 啮齿类动物饲料 | Harlan 实验室 | 啮齿类动物饲料 2019 | |
| 静脉导管 | MWI 兽医用品公司 | 009231 | 24 G x ¾ 英寸 |
| 电灼仪 | Bovie 医疗公司 | Aaron 900 | |
| 超声设备 | Sonosite | 180 Plus (兽用) | |
| MB49 细胞系 | 维克森林大学浸信会医学中心 | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| 胎牛血清 | Gemini Bio 产品公司 | 100106 500A57B | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140-163 |
参考文献
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
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