人外周血自然杀伤细胞的扩增、纯化及功能评估

摘要

本文介绍一种高效扩增和纯化大量人自然杀伤（NK）细胞并评估其功能的方法。

摘要

自然杀伤（NK）细胞在针对多种感染性微生物和肿瘤的免疫监视中发挥重要作用。NK细胞的可获得性有限，且扩增能力受限 体外 限制了自然杀伤细胞免疫疗法的发展。本文描述了一种高效扩增大量功能性自然杀伤细胞的方法 离体 使用表达膜结合型IL21的K562细胞作为人工抗原呈递细胞（aAPC）。

迄今为止，自然杀伤细胞（NK细胞）的过继疗法所使用的细胞产品，均通过供体的稳态白细胞分离术获得，随后进行T细胞耗竭或NK细胞的阳性筛选。该产品通常在IL-2中激活过夜，次日即予以输注¹。由于外周血中NK细胞频率较低，在临床试验中所输送的NK细胞数量相对较少。

NK细胞无法扩增 体外 一直是获得足够细胞数量以实现最佳临床效果的限制因素。仅通过高剂量IL-2已实现自然杀伤细胞（NK细胞）的一定程度扩增（在1-2周内扩增5-10倍）。 ²自体T细胞的活化可介导NK细胞扩增，可能也是通过局部细胞因子的释放实现的 ³. 间充质基质细胞或人工抗原呈递细胞（aAPCs）可支持外周血和脐血来源的自然杀伤细胞的扩增 ⁴使用抗体包被的磁珠联合激活NKp46和CD2目前已被用于NK细胞扩增（Miltenyi Biotec，Auburn CA），可在21天内实现约100倍的扩增。

使用aAPC扩增或激活的NK细胞的临床试验正在进行中，其中一项试验采用白血病细胞系CTV-1来启动和激活NK细胞⁵ 无明显扩增。第二项试验利用EBV-LCL进行NK细胞扩增，在21天内实现平均490倍的扩增⁶第三种方法利用经4-1BBL（CD137L）和膜结合型IL-15（mIL-15）转导的基于K562的aAPC⁷，可在21天内实现平均自然杀伤细胞扩增277倍。尽管如此，使用K562-41BBL-mIL15 aAPC扩增的自然杀伤细胞具有高度细胞毒性 体外 和 体内 与未扩增的NK细胞相比，其增殖因端粒缩短导致的衰老而受限，并参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）⁸最近有报道称，使用表达 MICA、4-1BBL 和 IL15 的 K562 细胞可实现 NK 细胞扩增 350 倍⁹.

本文所述的NK细胞扩增方法可在无衰老的情况下实现NK细胞的快速增殖，在21天内中位扩增倍数达到21,000倍。

方案

1. 从血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞

通过Ficoll-Paque密度梯度离心法从健康供体白细胞单采术获得的血沉棕黄层样本中分离外周血单个核细胞（PBMC）。

1. Ficoll-Paque 离心操作按照制造商提供的方案进行，仅作少量修改。
2. 向正常献血者血库的血沉棕黄层中加入 PBS，使其终体积达到 140 mL（典型的血沉棕黄层体积为 40–70 mL）。
3. 在4个试管中，每个试管加入15 mL Ficoll-Paque，然后将35 mL的血沉棕黄层样本小心铺在Ficoll-Paque上层。
4. 400g 离心 20 分钟，不启用刹车。
5. 从Ficoll-Paque与血浆界面处回收PBMCs，不要丢弃Ficoll-Paque底部的红细胞。
6. 用 PBS 洗涤 PBMC 三次，每次以 400g 离心 10 分钟。
7. 此阶段，PBMC 可直接用于 NK 细胞扩增，或通过 RosetteSep 分离 NK 细胞（第 4 节）
8. 剩余的PBMC可保存在含10% DMSO的FBS中，并置于液氮中冷冻。
9. 吸弃Ficoll，将第5步得到的红细胞收集至两个50 mL离心管中，用PBS洗涤三次（加至50 mL刻度线），每次均吸除上清液，吸取时贴近红细胞层表面以去除粒细胞。
10. 红细胞可立即用于RosetteSep法纯化NK细胞（参见 第4节）或等体积保存于Alsever's溶液中，置于4℃°C 以备后续使用（红细胞最多可保存 4 周）。

2. NK 细胞扩增

可使用外周血单个核细胞（PBMCs）或纯化的自然杀伤（NK）细胞启动NK细胞扩增。用于扩增的PBMCs数量可根据三周扩增后所需NK细胞的数量进行调整，详见代表性结果部分。（见注释1）

刺激 1

第0天

1. 每扩增 5×10⁶ 个 PBMC，计数并使用 γ 辐照装置在 100 Gy 条件下辐照 10×10⁶ 个 K562 Cl9 mIL21 细胞。
2. 辐照后，用 PBS 洗涤细胞，并重悬于 NK 细胞扩增培养基（NKEM）中。
3. 将 5×10⁶ 个 PBMC 与 10×10⁶ 个经辐照的 K562 Cl9 mIL21 细胞（按 1:2 比例）混合，加入 40 mL NKEM，接种于 T75 培养瓶中，直立放置于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中。

第3天和第5天

4. 以400g离心5分钟收集细胞，更换一半培养基为新鲜的NKEM（按全培养基体积添加新鲜IL2），并继续培养。

刺激 2

第7天

1. 在培养一周结束时，计数培养物中的细胞数量。
2. 留出 5×10⁵ 个细胞用于流式细胞术表型分析（见注释2）。
3. 对于每 5×10⁶ 个需要重新刺激的细胞，计数并使用γ射线辐照仪在 100 Gy 条件下辐照 5×10⁶ 个 K562 Cl9 mIL21 细胞。
4. 加入等数量的辐照 K562 Cl9 mIL21 细胞（1:1 比例），并重悬于 NKEM 中，总体细胞密度为 2.5×10⁵ 个细胞/mL（见注释3）。
5. 将细胞接种至 T75 培养瓶中（每瓶最多 50 mL）。

第10天和第12天

6. 计数细胞数量。
7. 根据细胞数量，用新鲜的NKEM完全更换培养基（见注释3）。

第14天

8. 扩增培养两周后，计数培养物中的细胞数量。
9. 留取 5×10⁵ 个细胞用于流式细胞术表型分析（见注释2）。
10. 若扩增起始于外周血单个核细胞（PBMCs），可在该扩增阶段采用 RosetteSep 纯化方案对自然杀伤（NK）细胞进行纯化（参见第四部分）。若扩增起始于已纯化的 NK 细胞，则直接进入第三次刺激步骤。
11. 纯化后，留取 5×10⁵ 个细胞用于流式细胞术表型分析，以验证 NK 细胞的纯度（同第8步）。
12. 使用全部纯化后的 NK 细胞进行第三次刺激（见注释4）。

刺激 3

1. 根据细胞数量，将NK细胞与经照射的K562 Cl9 mIL21细胞（1:1比例）重悬于NKEM培养基中（见注释3）。

第17天和第19天

2. 计数细胞数量。
3. 根据细胞数量更换新鲜的NKEM培养基（见注释3）。

第21天

4. 扩增三周后，计数培养物中的细胞数量。
5. 取 1×10⁶ 个细胞用于流式细胞术分析，进行完整的自然杀伤细胞表型抗体组合检测（见表1）。
6. 将细胞冻存于含 10% DMSO 的胎牛血清中，每管最多 5×10⁷ 个细胞，以供后续使用。

3. 自然杀伤细胞毒性检测

1. 在进行细胞毒性实验前一天，将一管NK细胞解冻并接种于NKEM培养基中，以使其恢复。
2. 每次使用单一靶细胞系进行NK细胞细胞毒性实验时，需要6×10⁵个NK细胞和3×10⁵个靶细胞（见注释5）。
3. 通过将Calcein-AM（DMSO中储存液浓度为1 mg/mL）稀释于NKEM中，制备CAM培养基（见注释6）。
4. 将10⁶个靶细胞重悬于1 mL CAM培养基中（见注释7）。
5. 在37 °C孵育1小时，期间偶尔轻轻振荡。
6. 将NK细胞重悬至1×10⁶个细胞/mL，并向U型底96孔板中对应的3个孔（对应图1中10:1的效靶比）各加入200 μL NK细胞悬液（见注释8）。
7. 除“最大释放”孔外，向其余所有孔中加入100 μL完全培养基。
8. 向“最大释放”孔中加入100 μL 2% Triton X-100。
9. 通过每次转移100 μL细胞悬液，对NK细胞进行连续稀释以获得后续5个效靶比，每次稀释后充分混匀。从最后一个孔（效靶比为0.3125:1）中弃去100 μL。
10. Calcein标记1小时后，用NKEM洗涤靶细胞两次，每次以1200 rpm离心5分钟（见注释9）。
11. 重新计数靶细胞，并将其重悬于1×10⁵个细胞/mL。
12. 向每孔加入100 μL靶细胞悬液（每孔含1×10⁴个细胞）。以100×g离心1分钟，以促进细胞接触。
13. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时。
14. 用100 μL移液器轻轻吹打混匀，使释放的Calcein均匀悬浮，然后以100×g离心5分钟使细胞沉淀。小心吸取100 μL上清液转移至新板，避免产生气泡。如有气泡形成，可用细针刺破。
15. 使用荧光酶标仪读板（激发波长485 nm，发射波长530 nm）。建议采用底部读数模式。
16. 根据公式[(实验释放值－自发释放值)/(最大释放值－自发释放值)] × 100计算特异性裂解百分率。

4. 采用 RosetteSep 法纯化 NK 细胞

1. 取红细胞数量为外周血单个核细胞或扩增细胞数量的100倍，加入50 mL离心管中（红细胞:单个核细胞 = 100:1）。
2. 若使用新鲜红细胞，请直接进行下一步；若红细胞保存在Alsever溶液中，则计数红细胞数量，并用含2% FBS的PBS洗涤适量（100倍过量）的红细胞，共洗涤三次，每次以1200 rpm离心10分钟。
3. 将步骤1.7中的红细胞与PBMCs或步骤2.10中扩增的细胞加入PBS + 2% FBS中，调整终体积为每5×10⁶个细胞1 mL⁷ PBMCs 或扩增细胞的
4. 加入1μL RosetteSep 人NK细胞富集鸡尾酒溶液每1×10⁶ PBMC 或扩增细胞的
5. 充分混匀，室温孵育20分钟，每5分钟轻柔混匀一次。
6. 加入等体积的 PBS + 2% FBS，轻轻混匀后缓慢铺加于 Ficoll-Paque 液面上方。
7. 重复第 I 节中所述用于分离 PBMC 的 Ficoll-Paque 离心步骤。
8. 计数纯化后回收的NK细胞，并留出5×10⁵个细胞用于流式细胞术检测NK细胞纯度（步骤8）。

5. 注意事项

注意 1. NK 细胞可直接从外周血单个核细胞（PBMC）扩增，或从 RosetteSep 纯化的 NK 细胞进行扩增。我们发现两种方法的扩增效率相似，但某些供体的 NK 细胞数量极低，可能导致在扩增前通过 RosetteSep 方法纯化时存在困难。

注意 2. 我们在扩增过程中常规使用 CD56-FITC、CD16-PE 和 CD3-PE-Cy5 进行表型分析，将 NK 细胞定义为 CD3 阴性且 CD16 或 CD56 阳性的细胞。

注意 3. 每次更换培养基或进行刺激时，将细胞重悬于 2.5 × 10⁵/mL 的浓度，以确保在扩增高峰期每毫升的 PBMC/NK 细胞数量保持在 200 万或以下。这将防止营养物质耗尽，有助于实现最大化的扩增和细胞存活。

注意 4. NK 细胞的扩增效率因供体而异，在第 1 或第 2 次刺激结束时，可根据实验需求将部分细胞冻存，另一部分继续扩增。我们此前成功地在后续时间使用冻存细胞进行了扩增。

注意 5. 为留出误差空间，我们建议在细胞毒实验中使用至少 7×10⁵ 个重悬于 700 µL NKEM 中的 NK 细胞，以及 4×10⁵ 个用 Calcein-AM 染色后重悬于 4 mL NKEM 中的靶细胞。若使用多通道移液器接种靶细胞，根据培养基容器的大小，可能需要更高体积的细胞悬液（最多可达 6×10⁵ 个细胞于 6 mL 中）。此外，推荐的 NK 细胞数量是针对本方案中所示的效靶比（E:T）设定的；若使用更高的效靶比，应相应增加每毫升中的 NK 细胞数量（例如，对于 40:1 的 E:T 比例，使用 4×10⁶ 个细胞/mL）

注意 6. 我们建议针对所选的目标细胞系进行初步的Calcein-AM负载滴定实验，使用以下稀释比例：1:500、1:400、1:300、1:200 和 1:100，以获得最大释放与自发释放之间的最佳差异。

注意 7. 使用贴壁细胞系作为靶细胞时，首先使用非酶细胞解离缓冲液制备单细胞悬液。若进行 ADCC 实验，需在 CAM 培养基中制备一份靶细胞的平行管。

注意 8. 若进行 ADCC 实验，将相同的 NK 细胞加入 3 个对应 ADCC 的效靶比为 10:1 的孔中。对其他供体重复该步骤。对其他靶细胞也重复该步骤。

注意 9. 如果进行 ADCC 实验，在钙黄绿素负载 45 分钟后，加入 10 µg 针对靶细胞、可诱导 ADCC 的特异性抗体。再孵育 15 分钟后，用完全培养基将靶细胞洗涤两次，每次以 1200 rpm 离心 5 分钟。将细胞重悬于完全培养基中，浓度为 1×10⁵ 个细胞/mL，并继续执行后续实验步骤。

6. 代表性结果

图2. 当按照上述方案，以5x10⁶个PBMCs作为起始材料进行扩增时，典型的NK细胞收获量范围为1x10⁸⁹ 至 10¹⁰ 细胞（存在供体依赖性差异）。该图显示了与原始产品中存在的NK细胞相比，NK细胞的扩增倍数（n=19，中位数±四分位距）。

图3. 扩增后的NK细胞表达多种NK细胞受体，除少数例外（CD11b、CD160和CD244）外，其表达情况与未扩增的原代NK细胞相当。

图4. 从血沉棕黄层中回收PBMCs的效果因供体而异，回收数量可在300×10⁶至800×10⁶之间。NK细胞可能占PBMCs的2%–18%。采用RosetteSep法对扩增后的细胞进行纯化时，第14天纯NK细胞的回收率为40–70%。按照推荐的扩增与纯化方案操作，可获得纯度达99%的NK细胞。

图5. 扩增的自然杀伤细胞（NK细胞）已显示出对多种肿瘤细胞系的细胞毒性，包括神经母细胞瘤、急性髓系白血病（AML）、骨肉瘤和黑色素瘤（代表性AML杀伤效果以特异性裂解百分比表示）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NK细胞扩增与激活培养基（NKEM）
90% RPMI 1640	Cellgro
10% 胎牛血清	Gibco
1× 青霉素/链霉素	Cellgro
1× L-谷氨酰胺	Gibco		使用前对培养基进行过滤除菌。
50 U/mL IL2	Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)		由200 IU/μL的储备液稀释而成。每次使用前将IL2加入所需体积的培养基中。
[header]
PBMC与NK细胞分离
Ficoll-Paque	GE Healthcare
Alsever's溶液	Sigma)
RosetteSep人NK细胞富集混合液	Stemcell Technologies)
[header]
NK细胞细胞毒性检测
Calcein-AM	Invitrogen
[header]
抗体
用于NK细胞表型分析的抗体列表如下表所示：
第1管：（总体积100）
抗体：同型对照FITC	BD Pharmingen	555748	体积：5
抗体：同型对照FITC	BD Pharmingen	555749	体积：5
抗体：同型对照FITC	BD Pharmingen	557224	体积：5
抗体：同型对照FITC	BD Pharmingen	340442	体积：5
抗体：FACS缓冲液	BD Pharmingen		体积：80
第2管：（总体积100）
抗体：CD56 FITC	BD Pharmingen	340410	体积：5
抗体：NKp30 PE	BD Pharmingen	558407	体积：5
抗体：NKp44 PE	BD Pharmingen	558563	体积：5
抗体：NKp46 PE	BD Pharmingen	557991	体积：5
抗体：CD3 PE-Cy5	BD Pharmingen	555341	体积：5
抗体：CD16 Alexa 647	BD Pharmingen	557710	体积：5
抗体：FACS缓冲液	BD Pharmingen		体积：70
第3管：（总体积100）
抗体：CD56 FITC	BD Pharmingen	340410	体积：5
抗体：KIR2DL1 PE	R&D Systems	FAB1844P	体积：5
抗体：KIR2DL2/3 PE	Miltenyi Biotec	130-092-618	体积：5
抗体：KIR3DL1 PE	R&D Systems	FAB12251P	体积：5
抗体：CD3 PE-Cy5	BD Pharmingen	555341	体积：5
抗体：NKG2D APC	BD Pharmingen	558071	体积：5
抗体：FACS缓冲液	BD Pharmingen		体积：70
第4管：（总体积100）
抗体：CD56 FITC	BD Pharmingen	340410	体积：5
抗体：CD11b PE	BD Pharmingen	555388	体积：5
抗体：CD3 PE-Cy5	BD Pharmingen	555341	体积：5
抗体：CD27 APC	BD Pharmingen	558664	体积：5
抗体：FACS缓冲液	BD Pharmingen		体积：80
第5管：（总体积100）
抗体：CD56 FITC	BD Pharmingen	340410	体积：5
抗体：CD266（DNAM-1）PE	BD Pharmingen	559789	体积：5
抗体：CD3 PE-Cy5	BD Pharmingen	555341	体积：5
抗体：CD160 Alexa647	eBiosciences	51-1609-42	体积：5
抗体：FACS缓冲液	BD Pharmingen		体积：80
第6管：（总体积100）
抗体：CD56 FITC	BD Pharmingen	340410	体积：5
抗体：CD244（2B4）PE	BD Pharmingen	550816	体积：5
抗体：CD3 PE-Cy5	BD Pharmingen	555341	体积：5
抗体：CD197（CCR7）APC	eBiosciences	17-1979-42	体积：5
抗体：FACS缓冲液	BD Pharmingen		体积：80