莱姆病的病原体的蜱肠道内的快速传递和本地化的方法

摘要

莱姆病的研究往往需要一代感染的蜱与莱姆病螺旋体的病原体，这一过程通常需要几个星期的。在这里，我们展示了一个基于显微注射蜱感染过程，可在数小时内完成。我们也证明内蜱免疫荧光法在B的螺旋体原位本地化。

摘要

莱姆病是由螺旋体的病原体伯氏疏螺旋体 ，保持它在本质上是由蜱灭鼠感染周期¹感染引起的。蜱传播的小鼠模型已发展到在实验室中研究莱姆病。虽然天真蜱可感染与 B 螺旋体感染小鼠喂养，蜕皮过程需要几个星期到几个月才能完成。因此，发展更迅速，更高效的蜱感染技术，如显微注射为基础的程序，是为^莱姆病3,4研究的重要工具。过程需要几个小时，以产生感染的蜱，并允许在同等数量的螺旋体的蜱队列交付的控制。这是B 的一代尤为重要螺旋体感染的蜱自然喂养利用老鼠进行的过程中失败，以确保100％的感染率和病原体的负担变化的潜在的结果除美联储蜱。此外，显微注射，可用于感染蜱与 B 螺旋体分离的情况下，弱毒株不能建立在小鼠体内的感染，并因此不能自然^由蜱5收购。这种技术也可用于成蜱提供多种其他生物材料，例如，特异性抗体或双链RNA ^6。在这篇文章中，我们将证明在体外生长B.若虫蜱显微注射螺旋体 。我们还将描述为莱姆病的病原体在蜱肠道使用共聚焦免疫荧光显微镜的本地化方法。

方案

1。微量注射若虫肩突硬蜱硬蜱

1。准备针

1. 编造通过加热和1毫米的玻璃毛细管（世界精密仪器）拉在一个玻璃微管拉拔设备（Narishige）显微注射针。小心地取出毛细管脆弱。
2. 商店在培养皿上胶带拉针（尖朝上）。

2。准备B。螺旋体

1. 成长B。在BSK培养基⁷ 螺旋体 ，直到浓度每毫升约10 ⁷细胞。通过使用一个佩特罗夫Hausser计数室（Hausser科学）的螺旋体是一个暗视野显微镜下计数。
2. 佩莱B。螺旋体 ，在室温为10分钟，在3000 XG离心。
3. 去除上清液，并完全重新悬浮颗粒BSK媒体通过200μL无菌微尖 ​​轻轻地传递到一个细胞每毫升¹⁰月9日的最后浓度。由于细胞重悬在高密度，可以聚集在一起，细胞悬液应当用于显微注射立即。

3。准备蜱

1. 放置在玻片上明确，双面胶带。
2. 在粘尘垫，小心取出若虫蜱，用小刷子的容器。
3. 被注入胶带，腹侧，面临着同样的方向，将所需数量的滴答。

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讨论

在这里，我们展示一个基于显微注射过程快速，高效的蜱若虫硬蜱感染的细菌病原体B.螺旋体 。我们还描述了B 的检测共聚焦免疫程序螺旋体在蜱肠道原位 。虽然我们的演示涉及若虫肠道，类似的程序也适用其他蜱的发育阶段，如幼虫^或成虫8,9 ，。然而，由于其较小的尺寸，该技术可能会比较具有挑战性的幼虫，但应在成年蜱适用。 与 B蜱人工感染其他方法螺旋体都得到发展，如通过玻璃毛细管¹⁰喂养或浸泡在培养基中^11。这些方法是高效，简单和相对便宜的的。然而，这些程序依赖于B 的转移相对失控螺旋体成单个蜱，从而有可能被限制在与平等的病原体负担出没蜱的同伙。后者的缺点可能会显着更多的控制下交付程序，如显微注射，克服。在我们的实验室中，我们经常采用这种转移 B.程序成蜱的感染率近100％，而且大多数蜱螺旋体生存的过程。注入蜱可存放在实验室几个星期到几个月，或立即允许大吃对小鼠和传输B。螺旋体感染。 B <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃毛细管	World Precision Instruments， Inc.	TW100F-4
立式玻璃拉拔器	Narishige International	PC-10
Petroff-Hausser 计数室	Hausser Scientific	3900
微量加载器 移液器吸头	Eppendorf	930001007
Femtojet 显微注射器	Eppendorf	920010504
足踏控制器 FemtJet	Eppendorf	920005098
磷酸盐缓冲盐水	Fisher Scientific	BP665-1	过滤灭菌