莱姆病的研究通常需要制备感染伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的蜱虫，这一过程通常需要数周时间。本文我们展示一种基于显微注射的蜱虫感染方法，可在数小时内完成。同时，我们还展示了一种用于在蜱虫体内原位定位伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）的免疫荧光方法。
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摘要
摘要
莱姆病是由疏螺旋体病原体Borrelia burgdorferi感染引起的，该病原体在自然界中通过蜱-啮齿类动物感染循环维持1。为在实验室研究莱姆病，已建立了一种蜱传小鼠模型2。虽然可以通过让 naïve 蜱取食感染小鼠来使其感染B. burgdorferi，但蜕皮过程需要数周至数月才能完成。因此，开发更快速高效的蜱感染技术（例如基于显微注射的方法）是研究莱姆病的重要工具3,4。该方法仅需数小时即可获得感染蜱，并可精确控制向一组蜱中递送等量的疏螺旋体。这一点尤为重要，因为利用小鼠进行自然取食感染所获得的B. burgdorferi感染蜱，无法确保100%的感染率，且可能导致取食后蜱之间病原体负荷量的差异。此外，在某些情况下，若减毒菌株无法在小鼠体内建立感染，因而不能被蜱自然获取时，显微注射仍可用于将B. burgdorferi分离株注入蜱体内5。该技术还可用于向蜱体内递送多种其他生物材料，例如特异性抗体或双链RNA6。在本文中，我们将演示对若虫期蜱进行in vitro培养的B. burgdorferi显微注射操作，并介绍一种利用共聚焦免疫荧光显微镜对莱姆病病原体在蜱肠道内定位的方法。
方案
1. 若虫显微注射 Ixodes scapularis 蜱虫
1. 准备针头
- 使用玻璃微电极拉制仪（Narishige）加热并牵拉1 mm玻璃毛细管（World Precision Instruments）制备若干显微注射针。小心取下易碎的毛细管。
- 将拉制好的针头（针尖朝上）存放于培养皿中的粘性胶带上。
2. 准备伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）
- 在BSK培养基中培养B. burgdorferi7，直至浓度达到约每毫升107个细胞。使用Petroff-Hausser计数板（Hausser Scientific）在暗视野显微镜下对螺旋体进行计数。
- 在室温下以3,000 × g离心10分钟，收集B. burgdorferi菌体。
- 弃去上清液，用200 μL无菌移液吸头轻轻吹打，将菌体完全重悬于BSK培养基中，最终浓度为每毫升109个细胞。由于细胞重悬时密度较高，可能发生聚集，因此细胞悬液应立即用于显微注射。
3. 准备受蜱
- 将透明双面胶带贴在玻璃载片上。
- 在防粘垫上操作，用小刷子小心地从容器中取出若虫期蜱虫。
- 将需要注射的蜱虫按所需数量放置在胶带上，腹面朝上，方向一致。
4. 注射蜱虫
- 使用20 μL移液器吸头（Eppendorf）将5 μL的B. burgdorferi菌液装入拉制好的毛细玻璃针中。检查针内是否有气泡滞留，如有必要，重新加载细菌培养物。
- 在解剖双目显微镜下观察蜱虫，聚焦于其肛门开口区域。轻轻触碰毛细针尖端，使其在直径略小于蜱虫肛门开口处断裂，形成显微注射针。此步骤至关重要，因为使用不合适针尖的注射操作会造成蜱虫损伤甚至死亡。
- 将固定好的蜱虫置于解剖双目显微镜下，聚焦于被两片可动肛板覆盖的肛门开口。使用精细镊子，轻柔地触碰并施加极轻微压力于肛门开口附近区域，使肛板分离，打开与肠道相连的肛门孔。小心地将针尖通过被强制打开的肛板略微插入肛门开口。针尖插入应尽量轻微，避免玻璃针尖损伤与直肠相连的半透明后肠。使用配备自动脚踏控制装置的显微注射仪（Eppendorf），按以下参数注射B. burgdorferi菌液：注射压力1,000百帕（hPa），注射时间0.2秒，补偿压力8 hPa。每只蜱虫仅进行一次注射。
- 显微注射后，蜱虫的行为应与注射前状态相似。例如，蜱虫应对刺激产生爬行反应。
- 通常将蜱虫置于环境培养箱中恢复48小时，培养箱条件设置为24°C、16小时光照/8小时黑暗光周期以及95%相对湿度。若无培养箱，可将注射后的蜱虫置于密闭容器（如普通干燥器）内的湿润环境中，于室温保存。如有需要，蜱虫的恢复时间也可缩短至数小时，随后即用于在小鼠身上吸血。
2. B. burgdorferi 共聚焦免疫荧光显微镜定位
1. 解剖蜱虫
- 在干净的玻璃载玻片上滴加一滴磷酸盐缓冲液（PBS）用于解剖，另在一片多聚-L-赖氨酸包被的载玻片（Sigma）用于显微镜观察。另准备一张带有双面胶带的玻璃载玻片。
- 用小刷子将蜱虫从容器中取出，并置于双面胶带上。
- 在解剖显微镜下观察并聚焦蜱虫。将锋利的剃须刀片置于蜱虫第一和第二对足之间，用力下压，将蜱虫切成两段，以暴露腹部。立即把腹部浸入一滴PBS中。
- 使用极细的镊子夹住切口周围的背侧和腹侧外骨骼。小心地将背板向上提起并远离蜱虫，以暴露呈棕褐色的肠道盲囊。操作过程中需始终将正在解剖的蜱虫置于PBS溶液下。
- 半透明的唾液腺束位于肠道前部区域的两侧，可根据需要在此时将其移除。用镊子固定住剩余的外骨骼，小心地将肠道从腹部拉出。
- 轻轻清洗肠道，去除任何残留的组织（例如气管）。
- 使用精细镊子的尖端，迅速将蜱虫肠道转移到载玻片上的一滴 PBS 液滴中，置于多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上L-赖氨酸包被的玻片。使用精细刀片或将精细镊子的尖端轻轻按压，将肠道分离成较小的片段。小心吸除肠道组织周围的过量PBS。
- 让肠道组织在室温下自然干燥。
- 将蜱虫肠道浸入丙酮中固定10分钟，室温下自然晾干。此步骤完成后，载玻片可在-20°C保存数月。20°C 在密闭容器中。
2. 染色
- 使用滤纸吸去组织周围的多余水分，并用疏水屏障笔（pap-pen）或其他疏水性标记工具在干燥的蜱肠道周围画一圈，以防止后续孵育步骤中染色液扩散。
- 在蜱肠道上覆盖一滴或多滴封闭缓冲液（PBS 中含 0.05% Tween-20 和 5% 山羊血清），室温孵育 30 分钟。封闭所用血清应根据抗体宿主动物来源选择。从此步骤开始切勿让玻片干燥。
- 缓慢吸去封闭缓冲液，随后加入适当的一抗和/或二抗溶液孵育。我们通常使用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的抗B. burgdorferi抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories），按1:100比例溶于封闭缓冲液中，室温孵育1小时。用铝箔包裹容器以避免光照。
- 轻轻吸去抗体溶液，再加入荧光染料对蜱组织进行染色，例如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或碘化丙啶（propidium iodide）。我们通常使用20 μg/mL碘化丙啶（Sigma）溶于PBS中，室温染色5分钟。
- 用含0.05% Tween-20的PBS洗涤3次。
- 将玻片用含抗荧光淬灭剂（如Slowfade，Invitrogen）的缓冲甘油封片，并小心加盖盖玻片。此步骤完成后，玻片可在密闭容器中于4°C保存数月。使用共聚焦显微镜观察并定位B. burgdorferi。
3. 代表性结果
图1展示了若虫期蜱进行显微注射时的位置，以及B. burgdorferi在蜱肠道中定位的图像。
图1. 显微注射与定位 B. burgdorferi 进入蜱虫肠道。
（A） 若虫的腹面观 I. scapularis 蜱虫已定位准备显微注射。插图中放大显示肛门孔（箭头所示）及插入的显微注射针（箭头）。使用精细镊子轻柔挤压虫体，使肛门板分离并打开肛门孔以便进行显微注射。注射针内充满考马斯亮蓝溶液，以增强可视性。 （B） 共聚焦免疫荧光成像的代表性结果 B. burgdorferi 蜱肠道内。显示的是肠道盲囊的前部区域。肠道细胞核和螺旋体（箭头）用碘化丙啶（红色）或FITC偶联的抗-B. burgdorferi （绿色），比例尺 = 20 μm.
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讨论
在此，我们展示了一种基于显微注射的方法，用于快速高效地将细菌病原体感染至若虫期的硬蜱（Ixodes ticks） B. burgdorferi我们还描述了一种共聚焦免疫荧光方法，用于检测 B. burgdorferi 在蜱虫肠道中 原位尽管我们的演示涉及若虫肠道，但类似的操作步骤也适用于蜱虫的其他发育阶段，例如幼虫或成虫 8,9然而，由于体型较小，该技术在幼虫中的应用可能相对困难，但适用于成年蜱虫的人工感染。其他人工感染蜱虫的方法 B. burgdorferi 已开发出多种方法，例如通过玻璃毛细管进行喂养 10 或通过浸入培养基中 11这些方法高效、简便且相对经济。然而，这些操作依赖于相对不可控的转移过程 B. burgdorferi 到单个蜱虫体内，因此在产生具有相等病原体负荷的感染蜱虫群体方面可能存在局限性。后一缺陷可通过更可控的递送方法（如显微注射）得到显著克服。在我们的实验室中，我们常规采用该方法进行病原体转移 B. burgdorferi 到感染率接近10...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢Pal实验室的成员在准备本演示过程中提供的帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家过敏与传染病研究所（NIAID）的PHS基金资助，项目编号为AI076684和AI080615。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| 垂直玻璃拉针仪 | Narishige International | PC-10 | |
| 佩特罗夫-豪泽计数室 | Hausser Scientific | 3900 | |
| 微量移液器吸头（Microloader） | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet 微注射仪 | Eppendorf | 920010504 | |
| FemtJet 脚踏控制器 | Eppendorf | 920005098 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific | BP665-1 | 过滤除菌 |
参考文献
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
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