蜱虫肠道内莱姆病病原体快速转移与定位方法

摘要

莱姆病的研究通常需要制备感染伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的蜱虫，这一过程通常需要数周时间。本文我们展示一种基于显微注射的蜱虫感染方法，可在数小时内完成。同时，我们还展示了一种用于在蜱虫体内原位定位伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）的免疫荧光方法。

摘要

莱姆病是由疏螺旋体病原体Borrelia burgdorferi感染引起的，该病原体在自然界中通过蜱-啮齿类动物感染循环维持¹。为在实验室研究莱姆病，已建立了一种蜱传小鼠模型²。虽然可以通过让 naïve 蜱取食感染小鼠来使其感染B. burgdorferi，但蜕皮过程需要数周至数月才能完成。因此，开发更快速高效的蜱感染技术（例如基于显微注射的方法）是研究莱姆病的重要工具^3,4。该方法仅需数小时即可获得感染蜱，并可精确控制向一组蜱中递送等量的疏螺旋体。这一点尤为重要，因为利用小鼠进行自然取食感染所获得的B. burgdorferi感染蜱，无法确保100%的感染率，且可能导致取食后蜱之间病原体负荷量的差异。此外，在某些情况下，若减毒菌株无法在小鼠体内建立感染，因而不能被蜱自然获取时，显微注射仍可用于将B. burgdorferi分离株注入蜱体内⁵。该技术还可用于向蜱体内递送多种其他生物材料，例如特异性抗体或双链RNA⁶。在本文中，我们将演示对若虫期蜱进行in vitro培养的B. burgdorferi显微注射操作，并介绍一种利用共聚焦免疫荧光显微镜对莱姆病病原体在蜱肠道内定位的方法。

方案

1. 若虫显微注射 Ixodes scapularis 蜱虫

1. 准备针头

1. 使用玻璃微电极拉制仪（Narishige）加热并牵拉1 mm玻璃毛细管（World Precision Instruments）制备若干显微注射针。小心取下易碎的毛细管。
2. 将拉制好的针头（针尖朝上）存放于培养皿中的粘性胶带上。

2. 准备伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）

1. 在BSK培养基中培养B. burgdorferi⁷，直至浓度达到约每毫升10⁷个细胞。使用Petroff-Hausser计数板（Hausser Scientific）在暗视野显微镜下对螺旋体进行计数。
2. 在室温下以3,000 × g离心10分钟，收集B. burgdorferi菌体。
3. 弃去上清液，用200 μL无菌移液吸头轻轻吹打，将菌体完全重悬于BSK培养基中，最终浓度为每毫升10⁹个细胞。由于细胞重悬时密度较高，可能发生聚集，因此细胞悬液应立即用于显微注射。

3. 准备受蜱

1. 将透明双面胶带贴在玻璃载片上。
2. 在....

讨论

在此，我们展示了一种基于显微注射的方法，用于快速高效地将细菌病原体感染至若虫期的硬蜱（Ixodes ticks） B. burgdorferi我们还描述了一种共聚焦免疫荧光方法，用于检测 B. burgdorferi 在蜱虫肠道中 原位尽管我们的演示涉及若虫肠道，但类似的操作步骤也适用于蜱虫的其他发育阶段，例如幼虫或成虫 ^8,9然而，由于体型较小，该技术在幼虫中的应用可能相对困难，但适用于成年蜱虫的人工感染。其他人工感染蜱虫的方法 B. burgdorferi 已开发出多种方法，例如通过玻璃毛细管进行喂养 ¹⁰ 或通过浸入培养基中 ¹¹这些方法高效、简便且相对经济。然而，这些操作依赖于相对不可控的转移过程 B. burgdorferi 到单个蜱虫体内，因此在产生具有相等病原体负荷的感染蜱虫群体方面可能存在局限性。后一缺陷可通过更可控的递送方法（如显微注射）得到显著克服。在我们的实验室中，我们常规采用该方法进行病原体转移 B. burgdorferi 到感染率接近10.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4
垂直玻璃拉针仪	Narishige International	PC-10
佩特罗夫-豪泽计数室	Hausser Scientific	3900
微量移液器吸头（Microloader）	Eppendorf	930001007
Femtojet 微注射仪	Eppendorf	920010504
FemtJet 脚踏控制器	Eppendorf	920005098
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP665-1	过滤除菌