由于缺血导致的急性肾损伤（AKI）的精确小鼠模型是研究急性肾损伤并可能发现治疗肾脏损伤方法的重要工具。悬挂重物系统提供了一种可立即、可靠地实现肾动脉闭塞和再灌注的工具，且不会引起肾充血。
本文内容
摘要
摘要
在住院患者中，超过50%的急性肾损伤（AKI）病例由肾缺血引起1-3。最近一项针对住院患者的研究显示，血清肌酐水平仅轻度升高（0.3至0.4 mg/dl）即与无升高者相比，死亡风险增加70%以上1。与此类似，需要主动脉和肾血管交叉阻断的外科手术，其术后肾衰竭发生率可高达30%4。同样，在常规情况下，超过10%的患者在心脏手术后会发生AKI，并伴随死亡率显著上升。AKI也是肝移植术后常见的并发症。至少有8-17%的患者最终需要接受肾脏替代治疗5。此外，肾移植过程中由于肾小管细胞损伤导致的移植肾功能延迟恢复，常与缺血相关性AKI有关6。此外，约20%的脓毒症患者会发生AKI6。AKI的发生与发病率和死亡率的显著升高密切相关1。目前可用的治疗手段极为有限，且大多数针对AKI的干预性临床试验在人体中均未成功。因此，迫切需要开发新的治疗策略以预防缺血所致的肾损伤3, 7-9。
为了阐明缺血所致肾损伤的机制及可能的治疗策略，迫切需要使用小鼠模型7-13。小鼠模型可利用多种遗传学工具，包括基因靶向小鼠和组织特异性基因靶向小鼠（cre-flox系统）。然而，小鼠肾缺血模型在技术上具有挑战性，实验细节对结果影响显著。我们对一种新型的小鼠肾动脉孤立性阻断模型进行了系统性评估，该模型特别避免了对肾蒂进行夹闭或缝合的操作14。由于实验设计限制，该模型需预先切除右肾，以便仅在单侧肾脏实施缺血操作。实际上，通过采用悬垂式负重系统，整个手术过程中仅需对肾动脉进行一次操作。此外，该技术不会造成静脉或尿道的阻塞。我们通过检测血清肌酐水平，证实该模型可产生具有时间-剂量依赖性且高度可重复的肾损伤。进一步与传统的全肾蒂夹闭模型相比，该新模型中缺血预处理所介导的肾脏保护作用更为显著且结果更可靠。因此，这一新技术可能对从事急性肾损伤研究的其他研究人员具有应用价值。
方案
一般注意事项。 所有操作均应在直立式解剖显微镜（Leica）下进行，并使用外科凝固器。实验组小鼠应在年龄和体重上相匹配，以确保结果的可比性。实验过程中应保持并监测体温、血压、麻醉和液体输注的稳定性。
1. 麻醉与手术
- 肾脏缺血实验可采用双侧肾脏同时施加缺血与再灌注的方法，或在单侧肾切除术后对残留肾脏进行缺血处理。由于双侧肾脏同时缺血处理存在技术难度更高、实验设置更复杂以及手术时间更长等问题，我们将先进行右肾切除术，随后利用悬挂重物系统对左侧残留肾脏实施缺血处理。我们此前也使用该悬挂重物系统进行心脏冠状动脉阻断。然而，操作过程有所不同，因为肾动脉可从周围组织中分离，而冠状动脉则位于心肌内部。
- 小鼠（8–14 周龄，性别不限）将以 70 mg/kg 剂量的戊巴比妥钠进行麻醉，并以约 10 mg/kg/h 的戊巴比妥钠维持麻醉。过量使用可显著降低血压，从而影响实验结果。在初期研究中，我们也曾使用氯胺酮和赛拉嗪，但这些化合物会引起明显的心动过缓（心率约 150 次/分钟）。除观察到心动过缓外，还有证据表明这两种药物在缺血条件下参与了保护机制。挥发性麻醉剂同样不可使用，因其可诱导肾脏保护效应并导致低血压。因此，我们最终选择戊巴比妥钠作为麻醉剂。此外，氯胺酮和赛拉嗪主要经肾脏排泄，肾切除和缺血可能延长氯胺酮的麻醉作用。
- 当痛觉反射消失（通过镊子夹捏脚趾测试）后，将小鼠置于温控加热台（RT，Effenberg，慕尼黑，德国），以维持体温在 37.0°C，并呈左侧卧位。
- 使用胶带将小鼠的下肢和上肢固定于手术台上。
- 对于非存活手术（如视频演示所示），在切口区域涂抹矿物油，以防止皮肤切开时吸入鼠毛，从而避免鼠毛过敏风险。对于存活实验，则需采用规范的无菌技术，包括剃毛、使用碘伏（如 Betadine）对皮肤进行消毒、无菌操作灭菌器械，以及外科医生佩戴口罩和无菌手套。存活手术中不使用矿物油，而使用无菌 NaCl。
- 使用剪刀和凝固电极（Erbe，ICC50，德国）进行右侧腰部切口，以防止肌肉和皮肤血管出血。与经腹正中切口进入腹腔的方法不同，该技术无需进入腹膜腔。
- 使用 4/0 蚕丝缝线结扎肾蒂（包括肾动脉和肾静脉），并用剪刀切除右肾，注意避免损伤肾上腺血管。
- 使用 4/0 缝线连续缝合肌肉壁和皮肤（两针）关闭手术切口。
- 随后将动物置于右侧卧位，并进行左侧腰部切口。
- 小心地将左肾从结缔组织中分离，避免损伤肾上腺及其血管。
- 接着，将肾脏腹侧朝下翻转并置入丙烯酸杯中。对于存活手术，丙烯酸杯应进行灭菌处理。用镊子夹住周围组织，将肾脏极部小心推入丙烯酸杯内，再用镊子进一步轻柔推入。使用浸有 37.0°C 水的湿棉签保持肾脏湿润和温暖。
- 在暴露左肾并将其置入丙烯酸杯后，将肾脏固定器在腹侧固定，以对肾血管施加张力。充分固定对成功将缝线置于肾动脉下方至关重要。随后固定肾脏固定器，肾动脉即可清晰辨认，因其位于肾静脉上方走行。
- 使用精细镊子从邻近组织中分离肾动脉，位置靠近其从腹主动脉发出的起始处。在最顶端使用弯头镊子将动脉从下方静脉中分离。
- 使用一把镊子作为引导，将 8/0 蚕丝缝线（Ethicon，Norderstedt，德国）置于肾动脉下方。该技术可仅阻断肾动脉血流，而不压迫肾静脉，与夹闭肾蒂的方法相比更具优势。
- 将缝线绕过一小杆（可使用经处理的安全别针），并在两端各悬挂约 1 g 的重物（Eppendorf 管）。可通过向 Eppendorf 管中加水或减水来调节重物重量以适应肾脏大小。但应使动脉轻微上提，确保无血流通过动脉，同时避免对动脉施加过大牵拉。过度牵拉可能导致血管壁损伤，引起动脉壁增厚并影响再灌注效果。
- 当重物未被支撑时，肾动脉立即被阻断；而当重物被支撑时，器官血流立即恢复。成功阻断可通过颜色由红变白来确认。
- 可根据实验需求设定不同的缺血时间。完全再灌注的程度取决于缺血持续时间。缺血时间不超过 45 分钟时，可导致可逆性肾损伤。在我们的实验设置中，采用 20 至 30 分钟的缺血时间，造成中等程度的肾损伤，以便根据小鼠品系和处理方式观察肾损伤的改善或加重情况。
- 完全再灌注后，可将肾脏从丙烯酸杯中复位。此时解除肾脏固定器的固定，释放对肾脏的张力。用钝头镊子轻轻将头侧极部从杯中取出，尾侧极部随之脱出。
- 解除小鼠固定胶带（胶带），并将小鼠置于仰卧位，以进行如 FITC-菊粉清除率测定等操作。
- 在部分实验中，可在整个手术过程中持续记录血压和心率。血压通过颈动脉导管连续测量。简言之，通过钝性分离气管旁肌肉暴露颈动脉。进一步暴露并小心避免组织损伤（特别是迷走神经），使用两根缝线和小夹钳将导管插入血管。血压使用 Statham 压力传感器（WK 280，WKK，Kaltbrunn，瑞士）测量。
- 为进行 FITC 标记菊粉清除率测定，需将导管插入左颈静脉，用于输注氯化钠和 FITC 标记菊粉。此外，还需插入膀胱导管，以按时间顺序收集尿液，具体方法如下文详述。
2. 肾损伤的检测
- 一般建议：以下结果参数可用于评估肾缺血后的肾脏损伤：
采用荧光素异硫氰酸（FITC）标记的菊粉清除率测定法评估肾小球滤过率（GFR）。作为替代方法，可在肾损伤后24小时通过代谢笼实验测定肌酐清除率和血清肌酐水平。在肾缺血后24小时进行肾脏H&E染色及髓过氧化物酶（MPO）ELISA检测，以评估肾脏损伤和炎症程度。 - 代谢笼实验：
- 缺血操作后，将左肾复位至腹膜后位置，并按上述方法缝合切口。
- 手术结束后，小鼠腹腔注射0.3 ml生理盐水，并在加热灯下恢复2小时。
- 随后将小鼠放入代谢笼（Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Germany）中，连续进行两次24小时的肾功能参数测定。
- 每只小鼠的饮水量需通过称量供水前和供水24小时后的空瓶与满瓶重量来确定。同时需记录小鼠体重。
- 24小时后，在短时间异氟烷麻醉下，通过毛细管从眼球后静脉丛采集约75μl血液。
- 在肾缺血后24小时，采用商用比色法（LT-SYS, Labor + Technik, Berlin, Germany）按照制造商说明书测定血浆和尿液中的肌酐浓度，以评估肾功能。使用火焰发射光度计（ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Germany）测定血浆和尿液中Na+、K+的浓度。肾排泄和血流动力学参数通过标准公式15-17计算得出。
- 菊粉清除率：在肾缺血后进行FITC-菊粉清除实验。
- 对左侧颈静脉进行插管以实现持续输注。使用解剖剪刀（Dumont, WPI）将静脉从周围组织中分离后，在静脉上打两道结（4/0）。在近端结扎线前方夹住静脉以阻断血流。随后结扎远端线结，并将一重物挂于远端缝线末端，以对静脉施加张力。此步骤至关重要，有助于导管顺利插入静脉。使用显微剪刀在静脉上剪开一小口，用精细镊子（Dumont, WPI）固定切口，将导管插入静脉。推进导管时移除夹子，确保导管无张力，以便无需手持即可顺利置入。随后在静脉和导管上方打紧第二道近端结扎线。
- 在膀胱中放置导管以进行定时尿液收集。为此，在膀胱上方皮肤做一小切口，小心将膀胱经皮肤切口拉出，用湿润纱布固定。在膀胱上预先放置一道缝线（4/0）。
- 截取一段短导管（1.5 cm），加热一端使其形成环状结构，便于在膀胱内固定导管。
- 在膀胱顶端剪开一小孔，注意在血管之间操作以避免出血。将导管较粗的一端插入膀胱，并在导管和膀胱上方收紧缝线固定。
- 所有小鼠均接受一次静脉推注，注射0.85%氯化钠溶液，剂量为体重的20%。持续输注速率维持在800 μl/h/25 g体重，并在输注液中加入FITC-菊粉，用于评估全肾肾小球滤过率（GFR）。动物稳定20分钟后，进行四次20分钟定时尿液收集，以测定尿流速率和FITC-菊粉浓度。每次收集时段的中点采集血液样本，用于测定FITC-菊粉浓度。
- 开始每次20分钟收集时使用计时器。将膀胱导管末端插入小型Eppendorf管中收集尿液。在收集前后称量Eppendorf管重量，以确定尿量。在每次收集时段的中点，通过毛细管从眶后静脉丛采集血液样本。
- 每次实验操作后可采集血液和肾脏组织，用于进一步分析，例如MPO ELISA、细胞因子ELISA、组织学检查等。
3. 典型结果：
图1. 用于肾缺血的悬挂重物系统的模型：已建立一种悬挂重物系统以诱导左侧肾脏的肾缺血。因此，将一根8.0尼龙缝合线置于肾动脉下方，并在每根缝合线的末端悬挂一个小重物（1 g）。该实验设计通过施加和解除重物负荷，实现肾动脉的可逆性阻断。
讨论
综上所述，本研究介绍了一种利用悬挂式砝码系统阻断肾动脉，在小鼠模型中实施肾缺血的新型技术。事实上，该方法可产生高度可重复的损伤，从而最大限度地减少因夹闭肾蒂所导致的变异性。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院基金资助 R01-HL092188、R01-DK083385 和 R01HL098294，以及麻醉教育与研究基金会（FAER）向 HKE 提供的基金、FAER 向 JYD 提供的基金，以及德国研究基金会（DFG，Deutsche Forschungsgemeinschaft）向 AG 提供的研究奖学金（GR2121/1-1）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊巴比妥钠 | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL 生理盐水溶液 |
| 丝线缝合线 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| 普罗林缝合线 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | 可重复使用 |
| 解剖显微镜 | Leica Microsystems | n/a | 建议选择工作距离较大的型号 |
| 加热台 | Rt, Effenberger, Germany | n/a | 唯一供应商 |
| 外科手术器械 | World Precision Instruments, Inc. | 精细微血管剪刀 |
参考文献
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