使用悬挂重物系统实现小鼠肝脏缺血

摘要

我们建立了一种用于门静脉三联体阻断的新型小鼠悬挂重物系统模型。该技术可能对未来研究小鼠肝脏缺血模型具有重要价值。

摘要

由于缺血导致的急性肝损伤可能发生在多种临床操作过程中，例如肝移植、肝肿瘤切除或创伤修复，且可能导致具有高死亡率的肝功能衰竭^1-2。因此，通过利用药理学和遗传学研究手段，小鼠肝脏缺血研究已成为一个重要科研领域^3-9。特别是组织特异性基因敲除小鼠（cre-flox系统）可帮助阐明特定组织中蛋白质的功能^10-13。由于手动夹闭小鼠门脉三联结构存在技术难度，我们采用了一种此前已有描述的悬挂式负重系统对门脉三联进行阻断，并进行了系统性评估³。使用该悬挂式负重系统时，我们可在不损伤肝叶的情况下将缝线环绕于门脉三联的左支，因为即使是最精细的血管夹也可能因肝组织与血管位置邻近而造成肝组织损伤。此外，肝三联的右支仍保持灌注，因此该技术不会引起肠道淤血，右肝叶的血流得以保留。同时，在整个手术过程中，门脉三联仅被操作一次。因此，诸如预处理（短暂缺血与再灌注）等操作可被轻松实施。通过对不同缺血与再灌注时间进行系统评估发现，肝缺血时间与肝损伤程度之间存在密切相关性，后者通过血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平进行测定^3,9。综上所述，这些研究证实，采用悬挂式负重系统进行肝缺血及间歇性再灌注时，可获得高度可重复的肝损伤模型。因此，该技术可能对其他从事小鼠肝缺血研究的研究人员具有参考价值。基于此，本视频提供了该技术的详细分步操作说明。

方案

一般注意事项。 所有操作均应在直立式解剖显微镜（Leica）下进行，并使用外科凝固器。实验组和假手术组的小鼠应在年龄和体重上相匹配，以确保结果具有可比性。在整个实验过程中，应保持并监测体温、血压、麻醉和液体输注的稳定性。

1. 麻醉与手术

1. C57BL/6小鼠的年龄应在10至16周之间，且各组之间应保持性别匹配。
2. 使用戊巴比妥钠（70 mg/kg 体重，腹腔注射）麻醉小鼠，并以约10 mg/kg/h的戊巴比妥钠维持麻醉。过量麻醉可显著降低血压，从而影响实验结果。
3. 将小鼠置于温控加热台（RT, Effenberg, Munich, Germany）上，并连接直肠温度探头至热反馈控制器，以维持体温在37 °C。
4. 将小鼠仰卧位固定于手术台上，用可移除胶带将四肢固定在台面上。
5. 若进行存活实验，必须采用适当的无菌技术，包括剃除毛发、使用碘伏（如Betadine）对皮肤进行消毒、无菌操作经高压灭菌的器械，以及术者佩戴口罩和无菌手套。

2. 门管区三联体阻断

1. 用矿物油覆盖切口区域，以防止在切割皮肤时吸入小鼠毛发，从而避免小鼠毛发过敏的风险。沿正中线行腹腔切开术，并向上端切开白线，以便充分暴露肝脏。如有可能，使用凝固电极（Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany）进行切口，以防止出血。
2. 将带有小鼠的加热板放置成尾部朝向外科医生的位置。该体位可为定位肝门三联结构及放置缝线提供最佳操作条件。
3. 使用湿润的棉签将肠道向右侧推移，以暴露门静脉三联结构（portal triad）。
4. 将中叶和左叶轻微向膈肌方向移动，右叶向肠道方向移动。这样可清晰显露位于右叶、中/左叶分叉上方的门静脉三联结构。
5. 仔细检查门静脉三联结构，并用无齿镊轻轻下压右肝叶，以便清晰观察左侧门静脉三联结构。
6. 确认目标位置后，使用持针器将缝针（7/0 尼龙缝线；Ethicon, Norderstedt, Germany）从左向右穿过左侧门静脉三联结构下方，确保包含肝动脉、肝静脉和左肝胆管。
7. 缝合位置必须紧贴三联结构下方。缝合过深可能损伤位于其下方的下腔静脉（vena cava inferior）。因此，在缝合前应使用镊子下压右肝叶，以辨认下腔静脉的位置。
8. 用镊子夹住针尖从右侧轻轻将其从肝脏区域拉出，避免损伤肝脏组织。
9. 在缝线两端各连接一个Eppendorf管（约3 g，装满水），并将两根缝线末端置于缝线固定装置上。将缝线固定装置置于缝合点远端，以确保缝线不会干扰右侧门静脉三联结构。
10. 通过施加重物，门静脉三联结构将立即被阻断，导致左叶和中叶肝脏的血供中断。成功的阻断可通过缺血肝叶出现明显的苍白变色来直观确认。相反，当从支架上取下重物、肝脏重新灌注时，颜色变化会迅速消失。该部分性肝缺血模型通过保留右肝叶的血流，避免了肠系膜充血的发生。
11. 将肠道复位至腹腔内。使用37.0 °C温水浸湿的纱布保持肝脏和肠道的温度。此外，手术完成后用市售食品保鲜膜覆盖小鼠体表，以维持体温稳定。
12. 根据实验方案要求进行缺血处理。在设定的缺血时间结束后，取下重物，中叶和左叶肝脏将立即开始再灌注。该技术可用于建立可逆性小鼠肝缺血模型。若不再进行后续缺血操作，应小心拆除缝线。
13. 在再灌注前15分钟及再灌注即刻，向腹腔内注入约400 μl氯化钠溶液。此后每30分钟补充100 μl液体，以补偿再灌注期间的液体丢失。
14. 对于存活实验，使用4/0缝线连续缝合肌层和皮肤以关闭手术切口。

3. 肝脏灌注的变化

建议采用以下结果参数来评估肝缺血后的肝损伤：

检测肝酶（如 ALT、AST）和肝组织学（H&肝缺血再灌注后的E染色^3,9.

图1. 用于肝脏缺血的悬挂重物系统的模型：已建立一种悬挂重物系统以诱导左叶和中叶肝脏缺血³。(A) 因此，尾状叶和右叶被轻柔地与左叶分离。随后将右叶轻微移位，以清晰观察右叶、中叶和左叶分叉处上方的门管三联结构。将一根8.0尼龙缝线置于左肝三联结构下方。(B) 在每根缝线末端连接一个小重物（装有水的3 g Eppendorf离心管）并施加拉力。左叶和中叶的颜色由红色变为苍白，表明肝脏缺血的发生。通过施加和释放重物负荷，该实验设计可实现对左肝三联结构的精确阻断和再灌注。

图2. 不同肝脏缺血时间对小鼠丙氨酸（ALT）和天冬氨酸（AST）氨基转移酶的影响。按照所示时间（0–60分钟缺血）诱导部分门三联体缺血。再灌注2小时后测定ALT（A）和AST（B）。结果以每组6–7只小鼠的均值±标准误表示。*P < 0.05，与0分钟缺血（假手术对照）相比。

讨论

本研究描述了一种在小鼠模型中通过悬挂式配重系统阻断左肝门三联体以实现缺血的技术。尽管该方法易于掌握，但仍需注意以下潜在问题。初学者常见的错误之一是缝合过深，导致门三联体和下腔静脉同时被缝入。由于阻力增加以及回心血量减少，小鼠的呼吸和心率将在15分钟内减慢，从而导致过早死亡。为避免累及下腔静脉，最佳方法是在缝合前用镊子压下右叶肝脏，以明确辨认下腔静脉的位置。另一个重要问题是配重不可过重，否则会对左、右门三联体造成过大压力，导致右叶血流也被阻断。因此，应根据小鼠体重调整Eppendorf管中的水量，并将缝线夹置于远离缝合部位的远端位置。相反，若配重过轻，则无法完全阻断血压。这两种错误均可通过肝脏颜色变化来快速识别：若右叶出现异常苍白，提示可能误伤右叶血供；若中叶和左叶颜色变化不充分，则提示阻断不完全。因此，在施加配重后应每10分钟检查一次肝脏颜色变化。另一个常见的手术并发症是缝针损伤肝脏组织。为此，应用钝头镊子压住右叶，以便清晰观察针尖，并使用持针器准确抓取。若在操作初期能充分注意上述问题，则悬挂式配重系统可因显著减少门三联体夹闭所引起的肝损伤变异性，而提供高度可重复的缺血性损伤模型。采用悬挂式配重系统后，整个手术过程中门三联体仅被操作一次，从而显著减轻对肝叶的机械损伤。此外，该技术不会引起肝或肠组织充血。相比之下，在反复夹闭和松开血管夹的过程中（尤其是在缺血预处理等涉及多次缺血循环的实验中），组织创伤更为明显。根据我们的观察，将悬挂配重置于远离肝组织的位置，可在确保可靠阻断的同时，避免因重复使用血管夹操作肝叶而导致的组织损伤。综上所述，本研究证实了悬挂式配重系统在缺血期间用于门三联体阻断的可行性，有效减少了传统夹闭方法所带来的变异性和局限性。因此，该技术可能对拟开展肝脏缺血研究的其他研究人员具有参考价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠（Fatal Plus）	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4 mg/mL 生理盐水溶液
缝合线，Prolene 8.0	美国强生公司，美国	M8739	可重复使用
解剖显微镜	Leica	n/a	考虑较大的工作距离
加热台	Rt，Effenberger，德国	n/a	唯一且单一的供应商
手术器械	WPI，Dumont		镊子，持针器
凝固器	Erbe, ICC50, 图宾根, 德国	n/a	不同类型的凝血装置供应商
<强>表1. 特定试剂与设备