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评估颅面发育过程中外胚层上皮的信号特性

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DOI：

10.3791/2557

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2011年3月24日

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California San Francisco

本文内容

摘要

本文介绍了一种组织移植技术，旨在测试颅面发育过程中头部表面外胚层的信号传导和模式形成特性。

摘要

鸟类胚胎易于获取的特性帮助实验胚胎学家理解了发育过程中细胞的命运以及调控脊椎动物图式形成和形态发生的组织相互作用（例如，1, 2, 3, 4）。在此，我们介绍一种利用这种可及性来检测面部发育过程中外胚层组织信号传导和图式形成特性的方法。在这些实验中，我们将覆盖在上颌区域的头部表面外胚层从鹌鹑或小鼠移植到鸡胚胎的相同区域或异位区域，从而构建鹌鹑-鸡5或小鼠-鸡6嵌合体。将鹌鹑组织作为供体移植入鸡胚胎的方法最初是为了利用鹌鹑细胞中存在而鸡细胞中不存在的核仁标记物，从而使研究者能够区分宿主与供体组织7。类似地，小鼠基因组中存在一种重复元件，并且广泛表达，这使我们能够在小鼠-鸡嵌合体中区分宿主和供体组织8。使用小鼠外胚层作为供体组织将极大拓展我们对这些组织相互作用的理解，因为这将使我们能够检测来自不同突变型胚胎的外胚层所具有的信号传导特性。

方案

1. 准备受体组织

  1. 准备培养基，磨制玻璃针，磨制钨针。
  2. 从蛋壳中取出胚胎，在冰上预冷的 PBS 中清洗。
    1. 使用 10 mL 注射器和 18 号针头，从蛋壳尖端吸取 1.0 mL 蛋白液。
    2. 用剪刀尖在蛋壳顶部开一个小孔，然后剪出一个圆形开口以暴露胚胎。
  3. 去除头部，并将其置于 DMEM（无血清，室温）中。
  4. 从胚胎中分离额鼻突组织（或其他供体部位，如上颌突或下颌突）。
  5. 在冰上用含 2.4 U/mL 中性蛋白酶（dispase）的 PBS 消化 20 分钟。
  6. 加入含 1% BSA 的 DMEM 覆盖组织，以终止消化反应。
  7. 使用磨制好的钨针分离外胚层、间充质和神经外胚层。
  8. 将移植物组织保存在含 1% BSA 的 DMEM 中，置于冰上，直至受体准备就绪进行移植。

2. 准备受体

  1. 暴露胚胎
    1. 使用10 mL注射器和18号针头，从蛋壳的尖端吸取1.0 mL蛋白。
    2. 用剪刀尖在蛋壳顶部开一个小孔，用胶带覆盖该孔，然后切割出一个圆形开口以暴露胚胎。
  2. 使用两对镊子夹住羊膜，轻轻撕开形成一个孔。
  3. 用一对镊子夹住右眼并施加压力，旋转胚胎头部。在固定头部的同时，使用钨针去除宿主外胚层，以便植入移植物。
  4. 使用玻璃移液管将移植物转移到宿主体内。
  5. 将移植物定位以替代被去除的外胚层。在移植物组织的每个角插入一根玻璃针，以固定移植物位置。制作玻璃针时，将微毛细管在酒精火焰上拉制成细尖。
  6. 用胶带紧密封住开口，并将胚胎放回培养箱中，孵育适当时间以供后续分析。
  7. 另见：9

3. 代表性结果：

为评估嵌合体，应收集胚胎并进行处理，以分析宿主与供体组织的分布情况。对于鹌鹑细胞的检测，可采用免疫组织化学方法，使用QcPN抗体（见： 3用于检测小鼠细胞， 原位 石蜡切片杂交被用于 6供体细胞应局限于上皮组织，不应出现供体间充质组织的迹象（图1）。若在间充质中发现孤立的供体细胞，则提示存在污染的神经嵴细胞，这些细胞会影响面部发育的多个方面，从而干扰对形态学结果的任何解释（例如， 10)。一旦确认移植物技术不含污染性间充质组织，即可采用进一步的形态学或分子学结果指标来评估嵌合体。就我们的研究目的而言，我们检测到了异位软骨和骨骼的存在，这些结构对应于由移植组织诱导产生的上颌重复结构（图2），以及间充质组织对移植物外胚层所产生的分子变化（图3）。5,6.

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图1. 嵌合体状态的评估 （A）抗QcPN染色用于检测鹌鹑-鸡嵌合体中的鹌鹑细胞。间充质中未见染色证据。（B） 原位 杂交技术用于检测小鼠-鸡嵌合体中SINE B2转录本的表达。表达局限于构成移植物的外胚层。

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图2. 三色染色显示上颌骨骼在（A）鹌鹑-鸡嵌合体和（B）小鼠-鸡嵌合体中的复制现象。

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图3. 外胚层调控间充质中的基因表达。（A）鸡胚间充质中正常的Bmp7表达（通过放射性原位杂交检测，阳性信号在Adobe Photoshop中伪彩为红色）。（B）在嵌合胚胎中，移植物相邻的间充质中Bmp7表达被诱导（箭头所示）。

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讨论

利用这种移植方法，我们得以确定外胚层含有调控上颌背腹极性和近远端延伸的信号信息。使用鹌鹑或小鼠外胚层时结果相似，且该组织中分子信号在多种物种间具有保守性6,11，表明这是脊椎动物中高度保守的信号中心。此外，其他研究者已采用类似技术检测头部表面外胚层不同区域的信号特性，发现外胚层中存在多个信号中心，参与面部形态发生过程12。该方法有助于进一步理解不同组织以及组织内区域差异在面部发育过程中的作用。最后，通过结合小鼠遗传学与禽类嵌合系统的优点，我们将能够阐明发育过程中上皮-间充质相互作用的分子介导因子，并揭示这些相互作用调控发育的机制。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由 R01-DE018234 和 R01-DE019638 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBSTektronix, Inc.TEKZR114
DMEM加州大学旧金山分校CCFDA003
BSASigma-AldrichA7906
DispaseGIBCO, by Life Technologies17105-041
35x10 mm 培养皿Falcon BD1008
5号Dumont镊子精细科学工具公司11252-20
剪刀精细科学工具公司14058-11
弹簧剪刀精细科学工具公司15010-11
持针器精细科学工具公司26016-12
钨针精细科学工具公司26000
微量毛细管Drummond Scientific3-000-225-G
巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-6B
弹簧剪刀精细科学工具公司15010-11
刀片架精细科学工具公司10052-11
剃刀刀片精细科学工具公司10050-00

参考文献

  1. Noden, D. M. The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues. Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).
  2. Bronner-Fraser, M., Stern, C. Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration. Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).
  3. Schneider, R. A. Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).
  4. Couly, G. Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development. 129, 1061-1061 (2002).
  5. Evans, D. J., Noden, D. M. Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells. Dev Dyn. , (2006).
  6. Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130, 1749-1749 (2003).
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  8. Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).
  9. Bollag, R. J. Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras. Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).
  10. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
  11. Eames, B. F., Schneider, R. A. Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development. Development. 132, 1499-1499 (2005).
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