高效的聚乙二醇（PEG）介导的苔藓Physcomitrella patens转化

摘要

本文介绍了一种简单高效的Physcomitrella patens原生质体转化方法。该方法借鉴自Physcomitrella原丝体原生质体和Arabidopsis叶肉原生质体转化的已有方案¹。

摘要

本文介绍了一种简单且高效的Physcomitrella patens原生质体转化方法。该方法改编自Physcomitrella原丝体原生质体和Arabidopsis叶肉原生质体转化的已有方案¹。由于Physcomitrella patens具有高效的有丝分裂同源重组能力，近年来已成为重要的模式生物系统²。这种特性使其能够实现高频的基因靶向^3-9，而这一现象在其他模式植物如Arabidopsis中并不存在。为了充分利用该系统，我们需要一种有效且简便的方法将DNA导入苔藓细胞。目前转化该苔藓最常用的方法是基因枪轰击¹⁰和聚乙二醇（PEG）介导的DNA吸收¹¹。尽管基因枪法可获得较高的转化效率¹²，但许多实验室难以获得基因枪设备，且该方案难以标准化。相比之下，PEG介导的转化无需特殊仪器，任何具备无菌操作台的实验室均可开展。在此，我们展示了一种简单且高效极高的苔藓原生质体转化方法。该方法每微克DNA可产生超过120个瞬时转化子，优于此前报道的最高效方案¹³。由于其操作简便、效率高且可重复性强，该方法既适用于需要大量转化子的研究项目，也适用于常规转化实验。

方案

1. 制备原生质体

1. 向培养皿中加入 9 mL 8% 甘露醇。
2. 用刮铲将来自 2–3 块 PPNH4 培养基的 7 天龄苔藓转移至含甘露醇的培养皿中。
3. 向培养皿中加入 3 mL 2% Driselase（Sigma D9515-25G）。
4. 将培养皿在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
5. 用 100 μm 孔径滤网（BD Falcon 352350）过滤原生质体悬液。
6. 将滤过的悬液在 250 g 离心 5 分钟，弃去上清液。
7. 用 500 μL 8% 甘露醇非常轻柔地重悬原生质体。
8. 在培养管中加入 9.5 mL 8% 甘露醇，确保原生质体完全悬浮。
9. 重复过滤和重悬步骤（1.6、1.7 和 1.8）再进行两次。
10. 取 10 μL 原生质体溶液，用血细胞计数板计数原生质体数量。
11. 将 16 个方格区域内的原生质体数量乘以 10,000，得到每 mL 原生质体的数目（见图 1）。

2. 转化

1. 将原生质体悬浮液在250 g条件下离心5分钟，弃上清液。
2. 用MMg溶液重悬原生质体，浓度为每毫升160万个原生质体。
3. 将原生质体悬浮液在室温下孵育20分钟。
4. 向含有60 μg DNA的培养管中加入600 μL原生质体悬浮液，轻轻旋转混匀。
5. 向原生质体与DNA的混合物中加入700 μL PEG/Ca溶液，轻轻旋转试管直至整个混合物均匀。
6. 将混合物在室温下孵育30分钟。
7. 在等待期间，用玻璃纸覆盖PRM-B平板（直径80 mm，A.A. Packaging Limited，UK）；使玻璃纸在平板表面至少水合5分钟。
8. 用刮铲去除玻璃纸与平板之间夹带的气泡。
9. 用3 mL W5溶液稀释混合物。
10. 将混合物在250 g条件下离心5分钟，弃上清液。
11. 将原生质体重悬于2 mL融化的PRM-T中（在加入原生质体前，该溶液可在42°C保持液态），每张覆盖有玻璃纸的PRM-B平板接种1 mL重悬的原生质体。用Micropore胶带（3M，Health Care）包裹平板，置于25°C培养箱中培养。
12. 或者，可将原生质体重悬于1 mL液体铺板培养基中，每张覆盖有玻璃纸的PRM-B平板接种0.5 mL。此方法可加快再生速度，但再生植株数量较少。
13. 培养箱设置为16小时光照、8小时黑暗的光周期。
14. 转化后第4天，将玻璃纸转移至新鲜的选择培养基平板上。

3. 代表性结果：

转化的一个示例见图2。本示例中使用的DNA为携带潮霉素抗性表达盒的7.8 kb超螺旋质粒。为拍摄照片，接种的原生质体数量减少至50%。图片是在将材料转移至筛选培养基两周后拍摄的。转化效率在DNA浓度达到60 μg之前不受影响；更高的DNA浓度则会对转化效率产生不利影响。实验数据显示，该方法在较宽范围的DNA用量下均能获得稳定一致的结果。该方法还能高效地产生稳定转化子，如表1所示：每微克线性化DNA可获得约4个稳定转化子，这一效率显著高于此前报道的结果¹⁴。

我们还通过转化携带荧光蛋白基因作为标记的环状质粒，检测了热激对转化效率的影响。热激处理在室温孵育（步骤2.6内）10分钟后进行，将混合物置于45°C水浴中孵育3分钟。热激后立即转入室温水浴中孵育17分钟。转化后22小时记录结果。有无热激处理所获得的转化子比例非常相近（约25%），但我们观察到热激对原生质体的活力产生了不利影响（数据未显示）。

图1. 血细胞计数板中原生质体的观察。 红色方框标示出用于原生质体计数的区域。注意计数原生质体所需的16个方格（见步骤1.11）；图像显示共计数到24个原生质体（240,000 个细胞/mL）。

图2. 18天大的瞬时转化子照片。 原生质体用指定量的环状质粒进行转化。A：15μg；B：30μg；C：60μg；D：120μg。

DNA 量 (μg)	转化效率 (转化子/μg DNA)
15，超螺旋质粒	120±24
30，超螺旋质粒	145±54
60，超螺旋质粒	121±60
120，超螺旋质粒	71±38
60，线性化质粒	4±1

表1. 不同DNA量下的转化效率。

讨论

本文介绍的方法可实现将DNA高效且稳定地转化到Physcomitrella patens原生质体中。该方法最初是为Arabidopsis¹开发的，但本文证明其在结构更简单、进化地位不同的Physcomitrella patens原生质体中同样具有良好的转化效果。因此，该方法经过少量优化后可适用于其他植物物种。可能的优化调整包括MMg溶液中的原生质体浓度、在MMg溶液及PEG/Ca溶液中的孵育时间等。在常规实验中，我们选择使用60 μg DNA，因为转化子数量随DNA浓度的增加呈线性增长，直至达到该数值（表1）。单次60 μg DNA转化可获得约7000个瞬时转化子或200个稳定转化子，足以支持对大量植株群体进行后续筛选与分析。

转化后的原生质体可使用液体铺板培养基或PRM-T进行铺板。尽管使用液体铺板培养基时再生效率较低，但当原生质体被超螺旋质粒转化时，我们选择此方法。如表1所示，使用超螺旋质粒DNA进行的转化可产生更多的转化子，因此即使使用液体铺板培养基，仍能获得大量植株。此外，使用液体铺板培养基铺板原生质体可实现更快的再生，这对于涉及瞬时表型的实验（如RNAi敲低实验^9,15）尤为重要。另外，由于无需顶层琼脂，便于后续进行免疫染色和RT-PCR分析的植株分离^9,15。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PPNH4			1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium.
PRM-B			PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates.
PRM-T			PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
Liquid Plating Medium			PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
2% Driselase			Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use.
MMg			0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7)
PEG/Ca			4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2
W5			154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7)