本文介绍了一种简单高效的Physcomitrella patens原生质体转化方法。该方法改编自Physcomitrella原丝体原生质体和Arabidopsis叶肉原生质体转化的实验方案1。
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摘要
摘要
本文介绍了一种简单且高效的Physcomitrella patens原生质体转化方法。该方法改编自Physcomitrella原丝体原生质体和Arabidopsis叶肉原生质体转化的已有方案1。由于Physcomitrella patens具有高效的有丝分裂同源重组能力，近年来已成为重要的模式生物系统2。这种特性使其能够实现高频的基因靶向3-9，而这一现象在其他模式植物如Arabidopsis中并不存在。为了充分利用该系统，我们需要一种有效且简便的方法将DNA导入苔藓细胞。目前转化该苔藓最常用的方法是基因枪法（微粒轰击）10和聚乙二醇（PEG）介导的DNA吸收法11。尽管基因枪法可获得较高的转化效率12，但许多实验室难以获得基因枪设备，且该方法的实验流程较难标准化。相比之下，PEG介导的转化无需特殊仪器，任何具备无菌操作台的实验室均可开展。本文展示了一种简单且高效极高的苔藓原生质体转化方法。该方法每微克DNA可产生超过120个瞬时转化子，优于此前报道的最高效方案13。由于其操作简便、效率高且可重复性强，该方法既适用于需要大量转化子的研究项目，也适用于常规转化实验。
方案
1. 制备原生质体
- 向培养皿中加入 9 mL 8% 甘露醇。
- 用刮铲将来自 2–3 块 PPNH4 培养基的 7 天龄苔藓转移至含甘露醇的培养皿中。
- 向培养皿中加入 3 mL 2% Driselase（Sigma D9515-25G）。
- 将培养皿在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
- 用 100 μm 孔径滤网（BD Falcon 352350）过滤原生质体悬液。
- 将滤过的悬液在 250 g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 用 500 μL 8% 甘露醇非常轻柔地重悬原生质体。
- 在培养管中加入 9.5 mL 8% 甘露醇，确保原生质体完全悬浮。
- 重复过滤和重悬步骤（1.6、1.7 和 1.8）再进行两次。
- 取 10 μL 原生质体溶液，用血细胞计数板计数原生质体数量。
- 将血细胞计数板中 16 个方格区域内的原生质体数量乘以 10,000，得到每 mL 原生质体的数量（见图 1）。
2. 转化
- 将原生质体悬浮液在250 g下离心5分钟，弃上清液。
- 用MMg溶液重悬原生质体，浓度为每毫升160万个原生质体。
- 将原生质体悬浮液在室温下孵育20分钟。
- 向含有60 μg DNA的培养管中加入600 μL原生质体悬浮液，轻轻旋转混匀。
- 向原生质体与DNA的混合物中加入700 μL PEG/Ca溶液，轻轻旋转至整个混合物均匀。
- 将混合物在室温下孵育30分钟。
- 在等待期间，用玻璃纸（直径80 mm，A.A. Packaging Limited, UK）覆盖PRM-B平板；使玻璃纸在平板表面至少水合5分钟。
- 用刮铲去除玻璃纸与平板之间夹带的气泡。
- 用3 mL W5溶液稀释混合物。
- 将混合物在250 g下离心5分钟，弃上清液。
- 将原生质体重悬于2 mL已融化的PRM-T中（在加入原生质体前，该溶液可在42°C保持液态），每张覆盖玻璃纸的PRM-B平板接种1 mL重悬的原生质体。用Micropore胶带（3M, Health Care）包裹平板，置于25°C培养箱中培养。
- 或者，可将原生质体重悬于1 mL液体铺板培养基中，取0.5 mL接种至覆盖玻璃纸的PRM-B平板。此方法可加快再生速度，但再生植株数量较少。
- 培养箱设定为16小时光照、8小时黑暗的光周期。
- 转化后第4天，将玻璃纸转移至新鲜的选择培养基平板上。
3. 代表性结果：
转化的一个示例如图2所示。本示例中使用的DNA为携带潮霉素抗性表达盒的7.8 kb超螺旋质粒。为拍摄照片，接种的原生质体数量减少至50%。图片是在植株转移至筛选培养基两周后拍摄的。转化效率在DNA浓度达到60 μg时不受影响，更高浓度的DNA则会对转化效率产生不利影响。实验数据表明，该方法在较宽范围的DNA用量下均能获得稳定一致的结果。该方法还能高效地产生稳定转化子，如表1所示；每微克线性化DNA可获得约4个稳定转化子，这一效率远高于此前报道的结果14。
我们还通过转化携带荧光蛋白基因作为标记的环状质粒，检测了热激对转化效率的影响。在室温孵育10分钟后（在步骤2.6内），将混合物于45°C水浴中热激3分钟。热激后立即将混合物转移至室温水浴中继续孵育17分钟。转化后22小时记录结果。有或无热激处理所获得的转化子比例非常接近（约25%），但我们观察到热激对原生质体的活力产生了不利影响（数据未显示）。
图1. 血细胞计数板中原生质体的观察。 红色方框标示出原生质体计数所需的区域。注意计数原生质体时所用的16个方格（见步骤1.11）；图像显示共计数到24个原生质体（240,000 个细胞/mL）。
图 2. 转化后18天的瞬时转化子照片。 原生质体用指定量的环状质粒进行转化。A：15μg；B：30μg；C：60μg；D：120μg。
| DNA 量 (μg) | 转化效率 (转化子/μg DNA) |
| 15，超螺旋质粒 | 120±24 |
| 30，超螺旋质粒 | 145±54 |
| 60，超螺旋质粒 | 121±60 |
| 120，超螺旋质粒 | 71±38 |
| 60，线性化质粒 | 4±1 |
表1. 不同DNA量下的转化效率。
讨论
本文介绍的方法可实现将 DNA 简便且稳定地转化到Physcomitrella patens原生质体中。该方法最初是为Arabidopsis1开发的，但本文证明其在结构更简单且进化上不同的植物Physcomitrella patens的原生质体中同样具有良好的效果。因此，该方法经过少量优化后可适用于其他植物物种。可能的优化调整包括 MMg 溶液中的原生质体浓度、在 MMg 溶液及 PEG/Ca 溶液中的孵育时间等。在常规实验中，我们选择使用 60 μg DNA，因为转化子数量随 DNA 浓度增加而呈线性上升，直至达到该用量（表 1）。单次 60 μg DNA 转化可获得约 7000 个瞬时转化子或 200 个稳定转化子，从而便于对大量植株群体进行后续筛选与分析。
转化后的原生质体可使用液体铺板培养基或PRM-T进行铺板。尽管使用液体铺板培养基时再生效率较低，但当原生质体被超螺旋质粒转化时，我们选择此方法。如表1所示，使用超螺旋质粒DNA进行的转化可产生更多的转化子，因此即使使用液体铺板培养基，仍能获得大量植株。此外，使用液体铺板培养基铺板原生质体可实现更快的再生，这对于涉及瞬时表型的实验（如RNAi敲低实验9,15）尤为重要。另外，由于无需顶层琼脂，便于后续对植株进行免疫染色和RT-PCR分析9,15。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
L.V. 由美国国家科学基金会（NSF，项目编号 IOS 1002837）资助
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PPNH4 | 1.84 mM KH2原生质体4 3.4 mM Ca(NO₃)₂3)2 1 mM MgSO₄4 2.72 mM 酒石酸二铵 54 μM FeSO₄4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO₄47H2O 0.22 μM CuSO₄45H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI 添加0.7%琼脂以制备固体培养基。 | ||
| PRM-B | PPNH4 用6%甘露醇和0.8%琼脂配制。加入10 mL 1 M CaCl₂2 在倒平板前定容至1 L。 | ||
| PRM-T | PPNH4 用6%甘露醇和0.6%琼脂配制。加入0.5 mL 1M CaCl₂2 使用前加至 50 mL。 | ||
| 液体铺板培养基 | PPNH4 用不含琼脂的8.5%甘露醇溶液，加入0.5 mL 1M CaCl₂2 使用前加至 50 mL。 | ||
| 2% 纤维素酶Driselase | 将 4 g Driselase (Sigma D9515-25G) 加入 200 mL 8% 甘露醇中，室温下轻轻搅拌 30 分钟，4 ℃ 孵育 30 分钟°C，在室温下轻轻搅拌5分钟。以2,500 g离心10分钟，弃去沉淀。用0.22 μm，并分装为10 mL等份冷冻保存。使用前于室温水浴中解冻。 | ||
| MMg | 0.4 M 甘露醇 15 mM MgCl2 4 mM MES（pH 5.7） | ||
| PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M 甘露醇 1 mL 1M CaCl₂2 | ||
| W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES（pH 5.7） |
参考文献
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