本文介绍了在小鼠颅骨上植入超薄聚酰亚胺基微电极阵列（PBM-array）以获取小鼠模型高密度脑电图（EEG）的手术步骤及操作要点。
本文内容
摘要
摘要
脑电图（EEG）反映了大规模神经元群体的平均电活动，广泛用作认知神经科学中无创脑功能监测工具，以及神经病学中癫痫和睡眠障碍的诊断工具。然而，EEG节律生成的潜在机制仍不明确。近年来引入的基于聚酰亚胺的高分辨率小鼠脑电微电极阵列（PBM-array）1，旨在利用小鼠模型丰富的遗传资源，探究复杂EEG生成过程中的神经生理学问题。将这种纳米制造的PBM-array应用于小鼠颅骨，是记录转基因小鼠大规模脑活动的有效工具，并有助于结合行为学识别特定EEG节律的神经关联。然而，PBM-array超薄的厚度和分叉结构使其在操作和植入过程中存在困难。本视频详细展示了PBM-array在小鼠颅骨上植入的准备与手术步骤，并提供了有助于研究人员成功完成植入的操作与手术技巧。
方案
1. 摘要
C57BL/6J - 129S4/SvJae 杂交小鼠（12~15 周龄）通过腹腔注射氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（6 mg/kg）混合物进行麻醉。手术前通过夹捏尾巴或脚趾检查麻醉深度。小鼠固定于立体定位仪（David Kopf Instruments，型号 902，Calif，USA）。在利多卡因局部处理以减轻疼痛后，沿中线切开头皮约 25 mm，暴露颅骨。使用生理盐水浸湿的棉签擦拭颅骨表面残留物，以增强电极与颅骨的贴附性。标记前囟和后囟点，并调整至同一水平面。将基于聚酰亚胺的微电极阵列（PBM-array）放置，使其垂直中线与颅骨中线对齐。前囟点应位于第 5th PBM阵列前部的电极层。在颅骨边缘的空白区域使用两到三个微型螺钉，以牙科水泥固定电极位置。为支撑PBM阵列连接器，我们在头部中线位置放置一个支撑杆，并用牙科水泥覆盖固定。待水泥固化后，缝合切口皮肤，并给予至少5天的恢复期。恢复期间，小鼠单独饲养于笼中，自由获取食物和饮水。恢复后进行脑电图（EEG）记录。动物护理、手术及记录程序均遵循韩国实验动物护理法规1992年法案及机构动物护理与使用委员会（IACUC）相关指南。本文所用PBM阵列的制备方法如Choi et al.所述。1 请联系作者以获取视频中使用的相同PBM阵列。
2. 实验步骤
- 准备灭菌的手术器械和立体定位仪。
- 用麻醉剂（例如，腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪，剂量分别为120和60 mg/kg）对小鼠进行麻醉。手术前通过尾部或脚趾夹捏以检测麻醉深度。
- 将小鼠固定在立体定位仪上，将耳杆插入小鼠耳道并拧紧固定。可用生物相容性凝胶（如凡士林）覆盖眼睛，防止手术灯光导致眼睛干涩。用70%乙醇润湿小鼠头部后，剃除头部毛发。
- 用手术刀在头部切开约25 mm。建议在头皮下注射少量2%盐酸利多卡因。使用微型钳子（Fine Science Tools (USA), Inc., 18052-03, Calif, USA）夹住皮肤，以保持切口充分张开。
- 用生理盐水浸湿的棉签擦拭颅骨上残留的组织碎片，以增强PBM阵列与颅骨的贴合性。使用过氧化氢去除膜残留物同样有效。
- 在颅骨上找到前囟点（bregma）和后囟点（lambda），并用油性记号笔标记。将PBM阵列放置，使其垂直中线与颅骨中线对齐，如图1所示。将前囟点置于第5行的中间位置th 用一滴自来水润湿PBM阵列前部的表面。从内侧向外侧轻轻擦拭薄膜电极，以确保更好地贴合。为了帮助薄膜电极更紧密地贴附在颅骨上，应使其在颅骨上完全干燥。薄膜电极依靠范德华力固定在颅骨上。当需要重新定位电极时，需再加一滴自来水，以防止电极撕裂。
图1. （左）小鼠颅骨上的PBM阵列。PBM阵列的前后轴与前囟（BP）和后囟（LP）之间的连线对齐。（右）小鼠脑表面的假定电极位置。小鼠脑解剖结构源自布鲁克海文国家实验室提供的成年C57BL/6J小鼠脑三维MRI数字图谱数据库，电极位置根据立体定位测量结果标出。右侧图中标注了接地（G）和参考（Ref）电极。 - 在颅骨的开放区域标记至少三个位置，然后使用牙科钻在这些位置钻孔，用于固定支撑用的微型螺钉。这些微型螺钉起到支柱作用，为颅骨上的牙科水泥提供机械支撑。钻孔时需格外小心，由于小鼠颅骨较薄，钻孔过程中容易发生出血。若出现出血，应立即停止钻孔，并向孔内加入少量止血粉。
- 将牙科丙烯酸树脂水泥（Vertex-Dental，Vertex Self-Curing，荷兰）涂抹于PBM阵列、固定螺钉及颅骨其余部位表面。将牙科水泥调配至黏稠胶状状态。
- 将一根硬质棒作为支撑杆，使用强力胶（例如 Loctite，Henkel Loctite Corp，Dublin，Ireland）固定在头部中央。在连接器平面的背面贴上双面胶带。调整 PBM 阵列连接器的位置，使其与支撑杆的顶端对接。连接器与颅骨之间的垂直距离应大于 5 mm。使用强力胶将连接器平面与棒的顶端粘合，以增强粘附性。
- 确保牙科水泥完全固化，然后将牙科丙烯酸水泥涂覆于颅骨及连接器底面，以将连接器固定在颅骨上。
- 移除微型夹具。使用无菌缝合线缝合切开的皮肤。将小鼠从装置上取下。可额外涂抹牙科丙烯酸水泥以保护暴露的颅骨。在水泥周围及缝合的皮肤处涂抹抗生素（夫西地酸软膏，韩国东和药房）。
- 将小鼠置于无菌笼具中饲养，直至其恢复至原始体重（约5至7天）。建议在此期间不要引入同笼伙伴。
- 恢复后，使用轻量级印刷电路板（PCB）连接器将小鼠连接至多通道脑电图放大器系统（Synamps）的头盒2美国北卡罗来纳州）的独立笼具中。连接管路应小心处理，避免缠绕。
- 经过1小时的适应后，进行脑电图（EEG）记录。本实验使用Scan 4.4.（美国北卡罗来纳州）采集软件。图2显示了典型的小鼠EEG时间轨迹集合。建议同步记录视频，以便关联小鼠的行为表现。
- 获得的信号可通过 MATLAB（MathWorks，Natick，MA，USA）进行分析，以生成脑地形图。图 3 展示了小鼠脑 EEG 功率图的示例地形图。
3. 代表性结果
如果上述手术操作正确执行，将能够成功完成40通道小鼠脑电图记录，且无不良通道。下图显示了典型的原始脑电图轨迹及地形图。
图 2. 注射γ-丁内酯（GBL，50 mg/kg，腹腔注射）诱导失神发作期间的脑电图（EEG）示例记录。红色条形表示失神发作期间的棘-慢波放电（SWDs）。横轴和纵轴分别表示时间和电压。通道编号遵循图1（右）中定义的导联组合。
图3. 拓扑图显示了2-6 Hz频段的功率分布。色标中的数值表示功率图的颜色尺度。在γ-丁内酯（GBL，50 mg/kg，腹腔注射）诱导产生棘慢波放电（SWDs）期间，大脑广泛额顶叶皮层区域的功率显著高于GBL注射前（基线）的功率水平。
讨论
本文报道了在自由活动的小鼠中获取高密度脑电图（EEG）的手术与记录方法。该方法使我们能够从小鼠模型中获得功能性脑图谱，以研究自发节律性1,2或事件相关脑活动的分子机制。
获取PBM阵列中所有通道的信号是实现全脑图谱绘制的必要条件，然而为每个通道建立稳定接触非常具有挑战性。为了保持各通道与颅骨之间的稳定接触，以下操作步骤至关重要。首先，颅骨表面的任何组织碎屑都可能导致电极与颅骨分离，因此必须使用无菌棉签彻底清除所有组织碎屑，并将颅骨表面擦干。其次，PBM阵列依靠范德华力附着于颅骨表面，建议在放置PBM阵列前，在颅骨表面滴加一滴自来水以形成水膜，有助于增强贴附效果。第三，牙科水泥的黏稠度必须适中：若过于稀薄，可能在PBM阵列下方形成绝缘层；若过于浓稠，则牙科水泥会因自身重量而容易从颅骨上脱落。最后，应在颅骨上植入至少三个支撑用的微型螺钉，以使牙科水泥牢固地固定在颅骨上。这些微型螺钉能够支撑牙科水泥并稳固头戴装置，对于长期实验研究尤为关键。
由于PBM阵列的尺寸和重量，其应用将仅限于成年小鼠的慢性研究。根据我们的经验，体重超过25 g的小鼠适合使用。在进一步的应用中，可通过PBM阵列分支之间的空白区域引入次级电极，用于记录或刺激目的。
致谢
由KIST基金（2E21510）、教育部国家荣誉科学家计划以及韩国国家研究基金会通过教育部、科技和知识经济部资助的脑科学原创技术研究计划（2010-0018944）支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| γ丁内酯 | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
参考文献
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
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