核酸微量定量的NanoDrop法

摘要

通过演示两种微体积核酸定量方案，阐述了NanoDrop微体积系统作为传统核酸定量方法实用且高效替代方案的应用。

摘要

生物分子检测技术正在不断发展，所用材料的量日益减少，通常使得传统的基于比色皿的仪器无法用于核酸定量，而能够进行微量定量的仪器则适用于此类情况。

NanoDrop 微量样品保留系统（Thermo Scientific NanoDrop 产品）通过结合光纤技术和天然表面张力特性，能够捕获并保留极微量的样品，无需依赖比色皿或毛细管等传统容器装置。此外，该系统采用更短的光程，从而实现广泛的核酸浓度检测范围，基本消除了稀释步骤的需要。减少光谱分析所需的样品体积，还有助于在多种分子实验流程中引入额外的质量控制步骤，提高实验效率，并最终增强对下游结果的信心。

随着实验技术的最新进展，对微量样品进行高灵敏度荧光分析的需求也日益凸显。利用相同的微体积样品保留技术，仅需 2 μL 样品即可完成荧光检测，从而显著降低荧光分析所需的样品体积。如今，借助专用的微体积荧光光谱仪，体积为 10 μL 或更少的微量反应已成为可能。

将演示两种采用集成样品保留系统的微量核酸定量方案，作为传统比色皿法的实用替代方法。首先介绍使用微量分光光度计的直接A260吸光度法，随后演示一种基于荧光的方法，该方法可利用微量荧光分光光度计实现反应体积降低的荧光检测。这些新技术可在样品消耗极低的情况下，实现对浓度范围从1 pg/μL到15,000 ng/μL的核酸进行定量分析。

方案

1. 使用 NanoDrop 2000c 分光光度计进行微量核酸定量

1. 首先，使用移液器吸取 2 至 3 μL 干净的去离子水至微量分光光度计样品保留系统的下部光学表面，以清洁上下光学表面。
2. 关闭杠杆臂，确保上部基座与去离子水接触。抬起杠杆臂，并使用干净、干燥、无绒的实验室擦拭纸擦拭两个光学表面。
3. 打开 NanoDrop 软件并选择“核酸”应用。使用小体积、经过校准的移液器，将 1 μL 缓冲液加到下部光学表面，进行空白测量。放下杠杆臂，并在“核酸”应用中选择“空白”。
4. 空白测量完成后，使用干净、干燥、无绒的实验室擦拭纸清洁两个光学表面。
5. 选择待测样品对应的常数。
   

   样品类型	选择选项	用于计算浓度的常数
   dsDNA	DNA-50	50
   ssDNA	DNA-33	33
   RNA	RNA-40	40
   寡核苷酸	自定义	15-150

   表 1. 使用 NanoDrop 微量分光光度计、结合 TrayCell 微量比色皿的传统比色皿型分光光度计，以及结合 PicoGreen 检测法的微量 NanoDrop 荧光分光光度计进行直接 A280 吸光度测定时，典型核酸浓度范围。
6. 将 1 μL 核酸样品加到下部光学基座上，并关闭杠杆臂。由于测量与样品体积无关，只需样品能够连接两个光学表面之间的间隙即可完成测量。
7. 在软件应用中选择“测量”。软件将自动计算核酸浓度和纯度比值。样品测量完成后，查看光谱输出结果。
8. 软件将自动计算核酸浓度和纯度比值。样品测量后，请查看光谱图像以评估样品质量。
9. 典型的核酸样品具有非常特征性的吸收谱型。
   
   图 1. 典型的核酸样品具有非常特征性的吸收谱型。
10. 与特定核酸分离技术相关的常见污染物来源包括苯酚/Trizol 法和柱式提取法。在苯酚/Trizol 提取过程中，残留试剂污染可能表现为 220 至 240 nm 范围内的异常光谱，以及 260 至 280 nm 区域的偏移。相反，柱式提取中残留的胍盐可能导致在 230 nm 附近出现吸收峰，并使原本位于 230 nm 的吸收谷偏移至约 240 nm。
    
    图 2. 样品 B 和 C 与样品 A 相比，其峰和谷的偏移说明了污染物如何影响核酸样品的光谱。
11. 为准确评估样品质量，应结合整体光谱质量分析 260/280 或 260/230 比值。纯核酸的 260/280 比值通常约为 1.8（DNA）和 2.0（RNA）。该比值受用于空白和样品测量的缓冲液 pH 值和离子强度影响。酸性溶液会使比值偏低 0.2–0.3，而碱性溶液则使比值偏高 0.2–0.3。显著偏离预期值的纯度比值可能表明存在蛋白质、苯酚或其他在 280 nm 附近有强吸收的污染物。260/230 纯度比值是评估 DNA 纯度的另一指标，纯核酸的该比值通常在 1.8–2.2 范围内。若纯度比值显著低于预期值，可能表明所用分离方法需要进一步优化。
12. NanoDrop 分光光度计也可用于通过直接吸光度法或蛋白质比色法测定蛋白质浓度。为确保液柱形成良好及结果可重复性，建议蛋白质样品使用 2 μL 的上样体积。请参考以下 JoVE 视频：《使用 NanoDrop 分光光度计进行微量蛋白质浓度测定》https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

2. 使用 NanoDrop 3300 荧光分光光度计进行高灵敏度微量核酸定量

1. 为演示使用 NanoDrop 3300 进行高灵敏度微量核酸定量，需采用 PicoGreen 荧光试剂盒。首先将试剂盒标准品及所有核酸样品平衡至室温。荧光样品对光敏感，应保存在琥珀色管或铝箔包裹的试管中。
2. 准备足量的 1x TE 缓冲液，用于所有待测标准品和样品，以及所需的 PicoGreen 工作液。按照生产商说明书，用无核酸酶水将提供的 20x TE 缓冲液稀释，制备 1x TE 缓冲液。反应体积可在 200 μL 至 10 μL 之间调整。本示例中，反应体积设定为 10 μL。
3. 在无核酸酶的离心管或试管中，以最终所需浓度的 2 倍浓度制备系列稀释的双链 DNA（dsDNA）标准品。将每种稀释后的 dsDNA 标准品各取 5 μL，转移至分别标记的无核酸酶琥珀色或铝箔包裹的试管中。
4. 将每种待测 dsDNA 样品各取 5 μL，分装至相应标记的无核酸酶琥珀色或铝箔包裹的试管中。
5. 根据生产商说明书配制 PicoGreen 工作液。向含有标准品或待测样品的每个试管中加入等体积的 PicoGreen 工作液（本示例中为 5 μL）。
6. 将等体积的 1x TE 缓冲液与 PicoGreen 工作液混合，制备阴性对照，作为参考溶液。
7. 通过轻柔吹打充分混匀各反应管内容物，并在室温下孵育 5 分钟。所有标准品和样品在测量前应平衡至相同温度，因为荧光信号受温度影响。
8. 准备仪器并进行测量时，首先清洁样品保留系统的下表面和上表面。吸取 2 至 3 μL 去离子水至下光学表面，关闭再打开杠杆臂，然后用洁净、无绒的实验室擦拭纸擦拭上下基座。继续操作前确保表面无残留绒毛，因为绒毛在激发光源存在下可能产生荧光，干扰测量结果。
9. 打开仪器软件，选择“核酸”应用，然后选择“PicoGreen-dsDNA”选项。
10. 为校准仪器空白，将 2 μL 的 1x TE 缓冲液加至下基座，关闭杠杆臂，然后在仪器软件界面中选择“空白”。空白校准完成后，用擦拭纸彻底吸除样品保留系统两个表面的空白溶液。
11. 通过轻柔吹打混匀参考溶液。使用低吸附性吸头，吸取 2 μL 至下基座，关闭杠杆臂。
12. 在测量类型中选择“参考”，并选择所需的单位。点击“测量”以启动测量循环。
13. 测量循环完成后，打开杠杆臂，并彻底吸除样品保留系统表面的液体。对参考溶液最多测量五个重复，每次重复使用新鲜分装的溶液。
14. 对其他标准品重复上述过程，以建立标准曲线。最多可使用七个标准品。软件设计为每个标准品最多存储五个重复值。标准品的重复测量值将被取平均，用于生成标准曲线，进而自动确定样品浓度。
15. 标准曲线建立完成后，选择“样品”标签页，输入相应的样品编号信息，并逐一测量各未知样品。

讨论

本文介绍的定量方法基于目前最广泛接受的微量体积系统。这类系统为传统的核酸定量方法提供了实用的替代方案，传统方法依赖较大的样品体积以及容器类设备的使用。

NanoDrop 微量技术采用一种依赖待测样品表面张力特性的样品保留系统，以形成液柱。样品必须与上下光学测量表面接触，才能正确形成液柱。如果在任何阶段测量结果显得不准确或不可重复，则最可能的原因是样品不均一或液柱断裂。

不建议使用洗涤剂和异丙醇作为清洁剂，因为它们可能会破坏基座测量表面的性能。当基座的疏水表面特性受损，导致样品液滴变扁平时，即发生基座性能破坏。性能受损的基座可能导致测量过程中液柱断裂。

图3. 未经处理的表面表现为水滴的摊平现象。

可使用 NanoDrop 基座表面修复剂（PR-1，Thermo Scientific NanoDrop Products）对未处理的基座表面进行重新处理。将一层薄薄的修复剂涂抹在上下基座表面，静置约30秒使其干燥，然后用干净、干燥、无绒的实验室擦拭纸擦去。成功修复的状态表现为：当水滴接触基座底面时会形成珠状。

图4. 经过再处理的表面表现为水滴形成珠状。

与传统的定量系统相比，微量体积定量系统显著减少了样品消耗量，并大幅扩展了浓度检测范围。尽管微量体积定量技术常用于细胞量有限的情况（如穿刺活检和激光捕获显微切割），但因其高效且操作简便，即使在样品充足的条件下，该方法也已成为传统核酸定量技术的广泛应用替代方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NanoDrop 2000c	赛默飞世尔科技公司	ND-2000C
NanoDrop 3300	赛默飞世尔科技公司	ND-3300