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使用电压敏感性染料对蟹类口胃神经节中神经元进行光学成像

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DOI：

10.3791/2567

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2011年3月23日

 ,  , 
1Institute of Neurobiology, Ulm University, 2School of Computing Science & Institute of Neuroscience, Newcastle University

本文内容

摘要

本文介绍了利用荧光电压敏感染料对蟹类口胃神经节神经元的详细活动进行快速、高分辨率成像的方法。

摘要

神经元的电压敏感染料成像技术是理解神经元网络如何组织，以及参与网络活动的多个神经元如何协同产生网络整体功能的关键方法。本文介绍了将该技术应用于蟹类口胃神经节中已鉴定的模式生成神经元的具体方法。我们演示了如何将荧光电压敏感染料Di-8-ANEPPQ加载到这些神经元中，并展示了如何使用MiCAM02高速高分辨率CCD相机成像系统对染料标记的神经元活动进行成像。我们还演示了如何利用与MiCAM02成像系统配套的BVAna成像软件对记录的成像数据进行分析。在蟹类口胃神经节中，将多个神经元精细活动的电压敏感染料成像与传统电生理技术（细胞内和细胞外记录）相结合，为深入理解中枢模式发生器神经网络的工作机制开辟了全新的研究途径。

方案

1. 螃蟹口胃神经系统标本的制备

成年癌症寄居蟹（Cancer pagurus L.）从当地来源（纽卡斯尔大学，多夫海洋实验室）获得，并饲养于过滤且充气的海水中（10 - 12°C）。动物在解剖前先用冰麻醉20–40分钟。我们使用了分离的口胃神经系统（STNS）1将STNS固定在涂有硅胶弹性体（ELASTOSIL RT-601，Wacker，Munich，德国）的培养皿中，并持续灌流冷盐水（10-13°C）。生理盐水的成分为（mMol·l-1）：NaCl，440；MgCl2，26；CaCl2，13；KCl，11；Trisma碱，10；马来酸，5。生理盐水保持在11 - 13°C pH 7.4 - 7.6

STNS 解剖与制备的详细步骤，包括口胃神经节（STG）去鞘过程，已在 Guttierez 和 Grashow 发表于 JoVE 的文章中展示。1所有实验均依照欧洲共同体理事会1986年2月24日颁布的指导方针进行th 1986年11月（86/609/EEC）。图1A展示了STNS的示意图，图1B展示了一个典型的去鞘STG，其神经元呈扁平半圆形排列于神经节的后部。

使用黏土将含有 STNS 的培养皿固定在成像显微镜（BW51 WI；Olympus，东京，日本）的操作平台上。显微镜载物台和显微镜本体均置于防震台（Scientifica，Uckfield，英国）上，以防止光学记录过程中产生运动伪迹。通过细胞外记录法监测口胃神经节（STG）中产生的运动模式2-4。具体操作步骤如下：

  1. 在主运动神经（lvn）的一段周围构建一个基于凡士林的圆柱形隔室，以将神经与浴液在电学上隔离（此操作在将培养皿置于成像显微镜的操作平台之前，在解剖台上完成）。
  2. 将两根不锈钢电极丝中的一根置于该隔室内，另一根置于浴液中作为参考电极。
  3. 使用交流差分放大器（Univ. Kaiserslautern, Germany）记录、滤波并放大差分信号。
  4. 使用示波器（DL708E；Yokogawa, Tokyo, Japan）监测神经节的运动活动，并使用数据采集板（CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK）和 Spike 2 v6.10 软件（Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK）进行额外记录。文件使用 Spike 2 v6.10（Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK）进行分析。

2. 染料溶液的制备

我们使用了荧光电压敏感染料 Di-8-ANEPPQ（Cambridge Bioscience）5，该染料带有双重正电荷，可通过施加正向电流脉冲促进染料经微电极加载。染料溶液应尽可能避光保存。染料溶液的配制方法如下：

  1. 将5 mg染料与1 mL DMSO（Invitrogen）中的F-127 Pluronic酸溶液混合。
  2. 将含有溶解染料的塑料离心管置于Sigma Microcentrifuge 1-14（Sigma, Osterode, Germany）中，以12,000转/分钟离心20分钟，以去除可能堵塞微电极的较大染料颗粒。
  3. 使用移液器分离染料溶液的上清液（顶部200 μL），并储存于另一个塑料离心管中。两个离心管均用铝箔包裹，避免光照。
  4. 将染料溶液在-20 °C下冷冻保存。
  5. 使用前，将密封并包裹好的离心管置于温水（25 °C）中10–15分钟，使染料溶液融化。

3. 使用尖锐微电极进行细胞内注射染料标记

我们使用锋利的微电极将染料注入神经元。为了检测染料的加载情况，我们采用 MiCAM02 成像系统（SciMedia，东京，日本）6。该成像系统配备两个 CCD 相机：HR 相机具有较大的传感器芯片（6.4 mm × 4.8 mm），可提供更优的空间分辨率，其最佳时间分辨率为 1.4 ms；HS 相机则具有较小（2.9 mm × 2.1 mm）但更快的传感器芯片，能够实现更快的成像速度，其最佳时间分辨率为 0.7 ms。染料加载的步骤如下：

  1. 使用P-97 Flaming-Brown（Sutter Instruments，Novato，CA，USA）电极拉制仪，将长度为10 cm、外径为1 mm、含丝的玻璃管（GB100TF 8P，Science Products，Hofheim，德国）拉制为微电极。电极在3M KCl溶液中的电阻应控制在25–40 MΩ范围内（具体的拉制参数设置请参考电极拉制仪制造商提供的移液器制作手册）。
  2. 冷冻的染料溶液融化后，吸取少量至微细针管（MicroFil - 34G, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA）中，吸入的染料填充约2/3rd 微细针的
  3. 将微填充针中的染料溶液注入微电极尖端。将微电极置于暗盒中15分钟。
  4. 微电极用3M KCl溶液反向填充。然后将电极放回暗色电极储存盒中，静置10-20分钟，使染料溶液在毛细作用力的吸引下到达微电极的尖端。
  5. 将制备好的微电极插入电极夹持器，并固定在细胞内放大器（IA-251A，Warner Instruments Corporation，Hamden，CT，USA）的前端装置上。
  6. 细胞内放大器连接至数据采集板，后者提供脉冲信号以驱动电流脉冲进入微电极。
  7. 使用微电极操纵器（PatchStar，Scientifica Ltd，Uckfield，UK）将微电极轻柔地插入STG神经元的膜中。由于成像显微镜的10倍物镜（UMPLFL10XW，NA 0.30，WD 3.3 mm；Olympus Corporation，东京，日本）工作距离非常小，微电极应置于倾斜位置（约 30°）将微电极移动至正确位置需要多次重新调焦显微镜物镜并调整微电极位置。首先将微电极移至其尖端位于STG上方的位置。降低显微镜物镜，直至在视野中清晰看到电极尖端。随后进一步降低物镜，但下降幅度不足以接触微电极。接着降低微电极，使其重新进入物镜的焦平面。重复上述步骤，直至神经元清晰地出现在物镜的焦平面上。然后继续降低微电极，直至其接触并轻柔刺穿所选STG神经元的细胞膜。此过程通过示波器进行监测。
  8. 使用细胞内电极记录所选 STG 神经元的活动，以根据其活动特征及其与细胞外电极记录的 STG 活动之间的关系来鉴定该神经元2,3,7.
  9. 细胞内放大器切换至电流注入模式，用于持续30分钟向微电极注入10 nA的正向电流脉冲，每个脉冲持续1秒，间隔1秒无电流注入。注入的电流可驱动带正电荷的染料分子进入被记录的神经元。若设备条件允许，可同时对多个神经元进行染料注入。
  10. 注射开始后10分钟及注射结束后，检查染料在神经元内的扩散情况。为此，我们使用MiCAM02成像系统（SciMedia Ltd，东京，日本），配备10倍物镜，并通过滤光镜组MSWG2（含480–550 nm激发滤光片；Olympus Corporation，东京，日本）利用超低纹波卤素光源（HL-151；Moritex，东京，日本）进行照明。成像系统设置为使用HR相机，分辨率为192 × 128像素，成像时间为40 ms，采用“hbin”模式，每次成像采集10帧图像。若染色填充成功，成像应显示在微电极位置附近的神经元内出现染色区域，且该染色区域在注射后10分钟和30分钟所采集的图像之间应有所扩大。若30分钟后染料扩散仍不充分，可延长注射时间，或更换新的染料电极。
  11. 将电极从神经元中抽出，让该神经元静置至少20-30分钟。在此期间，可对下一个神经元进行染料注射。

4. 染色神经元的成像

在染料填充后，可对单个神经元的活动进行成像。或者，也可对两个或多个神经元进行填充，以同时成像多个STG神经元的活动。原则上，可以对许多甚至全部STG神经元进行染料填充。神经元成像使用MiCAM 02成像系统配合HR相机完成。成像步骤如下：

  1. 更换显微镜物镜，采用高透光效率的 20 倍物镜（XLUMPLFL20XW/0.95，NA 0.95，WD 2.0 mm；Olympus Corporation，东京，日本）进行成像数据采集。该物镜比 10 倍物镜收集更多的光信号，同时提供更高的放大倍数，从而获得神经元更详细的图像。更高的透光效率意味着即使染料标记量较少，也能被该物镜清晰观察到，同时可降低成像时的光照强度，减少染料可能对神经元造成的光损伤。
  2. 调整显微镜的载物台位置，使待成像的神经元位于物镜视野范围内，并将物镜聚焦于这些神经元上。
  3. 细胞外记录数据也通过 MiCAM 02 成像系统的模拟输入通道输入系统中。这使得在分析阶段能够较为简便地将光学信号与相应的运动模式或细胞外记录的动作电位相关联。
  4. MiCAM 02 系统设置为使用 96 × 64 像素分辨率（成像时间为 2.2 ms）或 48 × 32 像素分辨率（成像时间为 1.5 ms）。在两种情况下，若神经元染色较弱，均可启用“hbin”设置。
  5. 将光照强度设置为尽可能低的水平（即神经元中的染料仍能产生足够的荧光信号用于成像），以避免记录过程中神经元发生光调制或光损伤。
  6. 关闭室内照明及所有其他光源。此外，可在记录装置周围拉上黑色帘布，以防止外部光源的光干扰。
  7. 成像时长设定为每次 4 至 16 秒。
  8. 对染色神经元的自发活动进行多次成像记录。

5. 光学成像数据的分析

为了分析成像数据，我们使用了与 MiCAM 02 成像系统配套的 BVAna 软件（版本 10.08；SciMedia Ltd，东京，日本）。该软件支持成像数据的可视化，并提供一系列分析工具。数据分析与解读的步骤如下：

  1. 在每条记录的神经元上选择一个合适的圆形兴趣区域。通常，在48 × 32像素分辨率下研究神经元时，我们使用半径为2–3像素的兴趣区域；在96 × 64分辨率下研究神经元时，则使用半径为6–8像素的兴趣区域。
  2. 可能需要对数据进行时间平滑处理，特别是当染料产生的荧光信号相对较弱时（数据中较低的背景值即提示此情况；这可能是由于使用的光照强度较低或染料负载水平较低所致，例如在记录神经元的神经突中）。在这种情况下，通常使用3–5个时间单位的时间平滑处理。
  3. 除了光学记录外，我们还通过选择显示成像系统的模拟输入信号来同步展示细胞外记录结果。
  4. 应适当设置光学数据和模拟输入信号的可视化参数，以便在计算机屏幕上清晰地同时显示所有记录信号。
  5. 结合神经元的光学记录、来自lvn的细胞外记录，以及基于先前细胞内记录对神经元的分类，可以确定该神经元的身份，并将其活动与来自神经的其他神经活动相关联。
  6. 预期光学记录能够清晰地显示与细胞外记录到的动作电位相对应的神经活动，以及由其他神经元活动引起的亚阈值事件（如抑制性突触后电位），且无需对多个相似事件进行平均处理即可识别。
  7. 可利用BVAna软件的数据导出功能，将选定兴趣区域的光学记录数据以及包含lvn记录的模拟输入信号导出。导出的数据还可使用其他数据分析软件进行进一步处理和分析（例如，最简单的情况下可使用Microsoft Excel（Microsoft, Redmond, WA, US）进行额外的可视化和数据处理）。

6. 代表性结果

图2展示了在蟹类胃心神经系统（STG）的幽门中央模式发生器中，同时记录两个神经元（LP，侧幽门神经元；PD，幽门扩张神经元）以及来自神经外的记录 lvn基于细胞内记录识别出的LP和PD神经元的光学记录显示，这些记录确实与对应于LP和PD神经元的细胞外记录高度吻合。光学记录与细胞外记录之间存在一致的12 ms延迟。 lvn 由于神经节与细胞外记录位点之间存在轴突传导延迟，导致记录到的峰电位峰值出现延迟（见图2插图）。所呈现的数据还表明，与记录神经元峰电位相对应的胞体神经活动能够被清晰检测到。

甲壳动物口胃神经节解剖结构；神经示意图与显微镜图像。
图1. A) 口胃神经系统（STNS）的示意图。CoG，连合神经节；OG，食管神经节；STG，口胃神经节；stn，口胃神经；lvn，侧脑室神经。B) 螃蟹的口胃神经节（STG）——图像显示了STG神经元呈半圆形的后部排列方式。

神经活动分析；电生理图，神经元放电模式；实验装置。
图 2. 同时记录一个 PD 神经元和一个 LP 神经元的单次扫描信号以及对 lvn 的记录。数据表明，光学记录与神经记录高度吻合，且我们能够识别出与神经记录中动作电位相对应的神经活动。插图显示了多个 LP 动作电位扫描的叠加结果——包括光学和电学记录的信号——及其平均值，展示了光学与电学记录活动之间的一致性。由于我们的光学记录方法未滤除数据中的低频成分，因此还能记录到 PD 和 LP 神经元特征性的缓慢膜电位变化14。

讨论

结合传统电生理学方法（细胞内和细胞外电极记录），对 STG 神经元进行电压敏感染料成像8,9，有助于更深入地理解这一虽小但结构复杂的神经系统的运作机制。STG 是中枢模式发生器（CPG）神经网络的典型代表（包含幽门胃磨节律网络）10,11，因此，对 STG 功能特性的涌现机制获得更深入的认识，也将有助于理解 CPG 网络如何产生其网络层面的功能。CPG 网络在运动控制12以及更高级的认知功能中13均发挥关键作用，因此，对其涌现特性的深入理解可能对神经科学的诸多领域产生重大影响。

致谢

我们感谢纽卡斯尔大学计算科学学院、科学、农业与工程学部，乌尔姆大学，以及 SciMedia 有限公司（日本东京）提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MiCAM02科学媒体成像系统
BVAna v.10.08科学媒体MiCAM 02 成像系统的数据分析软件
HL-151日本东京，Moritex超低纹波卤素光源
BX51 WI奥林巴斯株式会社用于落射荧光成像的直立显微镜
20倍成像物镜 奥林巴斯株式会社XLUMPLFL20XW/0.95数值孔径 0.95，工作距离 2.0 mm
10倍成像物镜 奥林巴斯株式会社UMPLFL10XW数值孔径 0.30，工作距离 3.3 mm
配备480-550 nm激发滤光片和590 nm发射滤光片的滤光片盒 奥林巴斯株式会社MSWG2
防震台Scientifica Ltd63-534
PatchStar 电极操纵器Scientifica LtdPS-7000C微电极操作器
CED Power 1401剑桥电子设计数据采集板
DL708E 示波器Yokogawa细胞内放大器
交流差分放大器德国凯泽斯劳滕大学细胞外放大器
P-97 拉针仪 – 布朗型电极拉制仪Sutter Instrument Co.电极拉制仪
Sigma 微型离心机 1-14Sigma-Aldrich离心
Genex Pipettors MlineScientific Laboratory Supplies LTDPIP7774PIP7774
带纤维丝的玻璃微量移液管科学产品GB100TF 8P微玻璃–电极
MicroFil – 34GWorld Precision Instruments, Inc.Microfil 针
Spike 2 v6.10剑桥电子设计电生理学软件
Di-8-ANEPPQ剑桥生物科学BT61014荧光电压敏感染料
F-127 Pluronic 酸，DMSOInvitrogenP-3000MP溶剂
NaClSigma-AldrichS9888蟹类生理盐水成分
CaCl2 2H2OSigma-AldrichC3881蟹类生理盐水成分
KClSigma-AldrichP3911蟹类生理盐水成分，电解质溶液
MgCl₂2 6H2OSigma-AldrichM9272蟹类生理盐水成分
Trizma 碱Sigma-AldrichT1503蟹类生理盐水成分
马来酸Sigma-AldrichM0375蟹类生理盐水成分
Elastosil RT-601Wacker，慕尼黑，德国培养皿包被

参考文献

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  14. Stein, W. Modulation of stomatogastric rhythms. J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).

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