本方案描述了一种通过荧光成像实时测量线粒体钙流的方法。该方法利用一种基于环状重排黄色荧光蛋白（YFP）的双激发比率型钙离子探针（ratiometric pericam-mt），该探针选择性地在线粒体中表达。
本文内容
摘要
摘要
细胞内钙离子浓度在各种刺激下发生的动态变化，调控着多种细胞过程，如增殖、分化和凋亡。1在细胞凋亡过程中，线粒体内钙的积累可促进促凋亡因子从线粒体释放到细胞质中2因此，直接测量活细胞中的线粒体钙具有重要意义 原位 在细胞凋亡过程中。利用双激发比率型和非比率型合成钙离子荧光染料对细胞进行高分辨率荧光成像，已被证实是研究细胞内钙信号传导多个方面的可靠且多功能的工具。使用这些技术测量细胞质钙流相对简单。然而，在完整细胞中使用如 rhod-2 和 rhod-FF 等合成钙指示剂测量线粒体内钙水平则更具挑战性。靶向线粒体的合成指示剂对线粒体钙浓度的重复升高反应迟钝，并会破坏线粒体形态。3此外，合成指示剂在数小时内倾向于从线粒体中泄漏，因此不适用于长期实验。因此，基于绿色荧光蛋白（GFP）的基因编码钙指示剂4 或aequorin5 靶向线粒体的探针极大地促进了线粒体钙动态的测量。本文介绍一种简单的方法，用于实时检测在不同刺激下线粒体钙通量的变化。该方法基于对特异性靶向线粒体的“比率型-周钙蛋白”（ratiometric-pericam）进行荧光显微观测。比率型周钙蛋白是一种基于环状重排的黄色荧光蛋白与钙调蛋白融合而成的钙离子指示剂。4钙离子与比率型pericam结合后，其激发峰从415 nm红移至494 nm，而发射光谱（峰值约515 nm）保持不变。比率型pericam与单个钙离子结合，解离常数为 体外 约 1.7 μM4这些ratiometric pericam的特性使其能够定量检测线粒体钙浓度的快速变化和长期变化。此外，我们还描述了如何将该方法适配于配备常规滤光片组的标准宽场钙成像显微镜。通过使用两种不同的激动剂——嘌呤能受体激动剂ATP和诱导凋亡的药物staurosporine，我们证明该方法适用于监测从数秒至数小时时间分辨率内的线粒体钙浓度变化。此外，我们还证明ratiometric pericam在检测凋亡过程中线粒体裂变/碎片化方面同样具有应用价值。因此，ratiometric pericam特别适用于在细胞凋亡过程中对线粒体钙动态进行持续、长期的测量。
方案
1. Pericam-mt 转染与细胞制备。
- 转染前一晚，将HeLa细胞接种于无菌玻璃盖玻片上，放入标准6孔培养板中。
- 按照制造商（Invitrogen）建议的方法制备DNA/Lipofectamine 2000复合物。每个孔使用4 μg的ratiometric-pericam-mt表达载体和10 μL Lipofectamine 2000，溶于0.5 mL Opti-MEM中。转染前细胞融合度应约为70%。
- 将每孔中的HeLa细胞培养基（DMEM高糖培养基，含10% FBS和青霉素/链霉素）更换为不含抗生素的相同培养基，每孔1.5 mL。
- 将DNA/Lipofectamine复合物加入待转染的各孔中，轻轻摇动混匀，于37oC、5% CO2的细胞培养箱中孵育4小时。
- 将无抗生素培养基更换为含抗生素的常规培养基，转染后让细胞表达ratiometric pericam 1–2天，然后进行成像。
2. 显微镜设置与图像采集
- 将载有HeLa细胞的盖玻片放入含有成像溶液的适当成像腔室中：107 mM NaCl, 7.2 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂2，1 mM CaCl2，11.5 mM葡萄糖、0.1%牛血清白蛋白和20 mM HEPES（pH 7.2）。本实验室使用Invitrogen的Attofluor细胞培养皿。将成像培养皿安装在倒置显微镜载物台上。
- 使用40倍（或更高）油浸物镜，找到一个含有一种或多种表达比率型pericam的细胞的兴趣区域。我们发现，比率型pericam在380 nm波长下对光漂白的耐受性较差，因此我们利用该波长来识别合适的细胞。图1中采集的图像采用了尼康Superfluor 40X物镜，数值孔径为1.3；更高倍数的物镜（60–100倍）也同样适用。激发滤光片使用的是Chroma Technology公司的D380/30x（380 ± 30 nm）和D495/10（495 ± 5 nm），二向色镜为505DCXR（505 nm长通），发射滤光片为HQ535/50m（535 ± 25 nm）。
用于获取图1图像的显微镜系统由尼康TE2000倒置显微镜组成，配备Roper Scientific Coolsnap HQ制冷CCD相机、Ludl MAC6000快速滤光轮和切换器，以及MetaFluor数据采集与分析软件。本方案可适配任何配备合适滤光片及能够采集和处理比率成像数据的软件的标准宽场显微镜。 - 使用495 nm和380 nm滤光片设置双激发波长的软件参数。钙离子与比率型pericam结合后会增加其在495 nm处的吸光度，因此应将比率设置为495 nm/380 nm。
比率型pericam在无钙条件下于415 nm处有激发峰4在本方案中，我们建议仅使用380 nm滤光片，因为该滤光片在大多数钙成像实验室中普遍存在。如果具备410 nm滤光片，则优先选用410 nm滤光片而非380 nm滤光片。 - 依次在495 nm和380 nm处交替激发以获取图像。在施加激动剂前，至少采集30秒的基础钙水平图像。 通过 灌流装置。标记每种激动剂的添加时间。应优化暴露时间和采集间隔，以防止光漂白，同时保证足够的时间分辨率。例如，在激动剂刺激下监测半快速钙动力学时，图1B和图1C中的图像每2秒采集一次。也可采用更快的采集速率。6长期成像在施用staurosporine后以较长的时间间隔（30秒）进行图像采集（图1 D和E）。
3. 图像处理与分析
- 实验完成后，可对获得的图像进行离线分析。定义感兴趣区域（ROI），用于监测钙水平的变化。如有必要，可选择视野中空白区域的 ROI 以扣除背景信号。需要注意的是，线粒体具有较高的运动性和动态性，因此长时间追踪单个线粒体内的事件并不总是可行的。因此，鉴于该细胞器在某些细胞类型中具有高度运动性，应仔细监控 ROI 的选择。此外，如图1所示，线粒体对不同刺激的反应具有异质性。因此，进行离线数据分析，并逐帧监控 ROI 位置至关重要。有关在高运动性线粒体中测量线粒体钙水平的详细方法已在其他文献中描述7。
- 从 ROI 获得的比值测量数据可导入 Excel 或类似的绘图软件中。数据可表现为单个细胞或单个线粒体内线粒体钙水平变化的轨迹，也可表现为多个 ROI 荧光信号的平均值。我们还曾利用该技术测量由 Fas 配体诱导凋亡的淋巴细胞群体中的平均线粒体钙水平8。
4. 代表性结果：
图1. (A) 比值型-pericam-mt的亚细胞定位。第一张图像显示表达比值型-pericam-mt的活HeLa细胞。第二张图像显示使用线粒体选择性染料MitoTracker Red CMXRos进行的荧光染色。合并图像中的黄色荧光表明比值型-pericam-mt与MitoTracker荧光的共定位。(B) 表达mt-比值型pericam并用10 mM ATP处理的4个HeLa细胞的一系列伪彩比值（495:380 nm）图像。(C) 用10 mM ATP处理的感兴趣区域（ROI）内线粒体钙水平变化的定量分析，该区域如(B)所示。(D) 表达mt-比值型pericam并用0.5 μM星形孢菌素处理的单个HeLa细胞的一系列伪彩比值（495:380 nm）图像。可见单个线粒体钙反应的异质性，以及60分钟时明显的线粒体碎片化。一些线粒体出现钙浓度的振荡性升高（白色箭头），而另一些则未显示钙水平的显著变化（黄色箭头）。(E) 用0.5 μM星形孢菌素诱导凋亡后，单个HeLa细胞中整体线粒体钙水平升高的定量分析。
讨论
在此，我们介绍一种利用线粒体靶向的比率型 pericam 测量线粒体钙离子的简便方法。如图 1A 所示，使用标准的宽场光学系统且无需去卷积，即可以可接受的信噪比清晰观察 HeLa 细胞中的单个线粒体。这是因为 HeLa 细胞与大多数贴壁培养细胞类似，在贴壁生长时会显著变扁平，从而无需共聚焦显微镜或其他专用设备。我们在贴壁于聚赖氨酸包被盖玻片的 Jurkat 细胞中也获得了类似结果。8与使用染料的方法相比，还可利用基因编码的钙指示剂（如比率型pericam）非侵入性地持续数小时监测线粒体钙水平（图1E）。这在分析细胞死亡过程中的线粒体钙变化时尤为重要。此外，还可直观观察凋亡过程中线粒体的分裂/碎片化现象。如图1D和E所示，星形孢菌素处理可导致部分线粒体亚群中的钙水平缓慢升高，并在20分钟时达到峰值。随后，钙水平随线粒体碎片化而下降，并在处理后2小时再次上升。这一动态与利用Fura-2检测到的星形孢菌素诱导的胞质钙缓慢波动一致。9因此，可获得重要的动力学信息，而采用静态测量方法则无法实现这一点。尽管图1中展示的是比值而非钙离子浓度，但该传感器仍可进行校准 原位 计算绝对钙浓度4, 10需要注意的一个重要问题是，比率型pericam对pH敏感。4, 10由于细胞质和线粒体的pH水平在细胞凋亡过程中可能发生显著变化11，这是一个重要的考虑因素。在表达pericam的分离线粒体中进行pH滴定表明，随着[H+] 在495 nm激发时会增加pericam的发射光，而在410 nm激发时对其发射光影响较小，这一特性已被用于同时测量线粒体钙离子浓度和pH值12因此，使用410 nm激发光选择性监测发射信号，可实现对线粒体钙离子的非比率式监测，同时减少对pH变化的干扰。最后，本文所述方案仅需配备常规滤光片的普通落射荧光显微镜，使该技术可被大多数实验室所采用。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Atsushi Miyawaki 提供 ratiometric-pericam-mt 表达载体。本研究由美国国立卫生研究院（DB）资助，资助编号为 GM081685。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 倒置宽场荧光钙成像显微镜 | Nikon Instruments | MEA53310 | 任何配备380 nm/495 nm激发滤光片以及适当长通和发射滤光片的倒置宽场显微镜均可轻松适配本实验方案。 |
| 成像软件 | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor细胞培养腔室 | Invitrogen | A-7816 | 任何可用于倒置显微镜并支持灌流的成像腔室均可满足需求。 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | 大多数转染试剂或实验方案均适用于本研究 |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
参考文献
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