聚焦离子束刻蚀与脑组织扫描电子显微镜观察

摘要

本方案描述了如何在聚焦离子束扫描电子显微镜中对树脂包埋的脑组织进行三维制备与成像。

摘要

本方案描述了如何使用聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）对脑组织等生物样品进行三维成像。样品首先用醛类固定，再使用四氧化锇和醋酸铀酰进行重金属染色。随后用酒精脱水，并浸入树脂中，然后使树脂硬化。利用光学显微镜和配备玻璃刀的超薄切片机，制备出包含靠近表面的目标区域的小块样品。将该样品块放入FIB/SEM中，用离子束沿样品块一侧靠近目标区域处粗略地铣削出一个垂直切面。利用背散射电子对下方结构成像，再用更精细的离子束铣削出一个较小的切面，并更仔细地观察表面，以确定需要成像和铣削的精确区域。随后设置显微镜参数，使该切面被反复铣削和成像，从而在样品块内部连续采集一系列图像。图像堆栈通常包含各向同性的体素，每个方向上的尺寸可小至4 nm。这种在任意成像平面内的图像质量，使用户能够在图像堆栈内以任意观察角度分析细胞的超微结构。

方案

1. 样品固定与树脂包埋

1. 将新鲜组织和细胞样品在 pH 7.4 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液中，用 2% 多聚甲醛和 2.5% 戊二醛固定至少 2 小时。样品厚度不得超过 0.150 mm，以确保固定剂充分渗透，且固定时间不应超过 12 小时。
2. 将样品放入 20 ml 玻璃闪烁瓶中，用 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液清洗三次，每次 5 分钟。
3. 用含 1.5% (w/v) 亚铁氰化钾和 1% (w/v) 四氧化锇的 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.4）染色 30 分钟。
4. 用 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液中的 1.0% (w/v) 四氧化锇染色 30 分钟。
5. 用双蒸水冲洗一次，持续 3 分钟。
6. 用双蒸水配制的 1% (w/v) 醋酸铀染色 30 分钟。
7. 用双蒸水冲洗切片 5 分钟，然后依次通过梯度乙醇系列脱水，每次更换溶液，每步 2 分钟（50%、70%、90%、95% 各一次，100% 两次）。
8. 用乙醇配制的 Durcupan 树脂逐步浸透，每次更换溶液后作用 30 分钟，起始浓度为 50% Durcupan 溶于乙醇，随后依次为 70%、90%、95%，最后为 100%。
9. 更换新鲜 Durcupan 树脂，缓慢振荡 4 小时。
10. 使用木制牙签将切片转移至涂有模具分离剂的玻璃载玻片上，置于 65°C 烤箱中聚合 24 小时。

2. 为聚焦离子束/扫描电子显微镜制备样品

11. 将含有样品的树脂层从两片玻璃载玻片之间分离，并彻底清洗以去除任何模具分离剂。
12. 使用配备低倍物镜的透射光显微镜，或具有透射照明的解剖显微镜，确定树脂切片中感兴趣区域的位置。
13. 使用剃刀刀片在感兴趣区域周围切割一个较小的方块（3 mm × 3 mm），并用丙烯酸胶将其粘附至空白树脂块的顶部（图1）。等待5分钟使胶水固化，然后进行下一步操作。
14. 将树脂块夹入超薄切片机的样品夹持器中，并利用附带的立体显微镜，用剃刀刀片修切感兴趣区域周围，直至仅剩下一个微小的金字塔形材料。
15. 使用固定在超薄切片机上的玻璃刀进一步修整树脂块，使感兴趣区域能够相对于块体表面的尺寸被精确定位（图1）。在靠近感兴趣区域的一侧切割树脂块边缘，使切口垂直穿过样品（图1和图2）。此切面即为成像面（图2）。
16. 将树脂块从超薄切片机中取出，并使用透射光显微镜拍摄块体内感兴趣区域的照片。
17. 使用珠宝锯将修整后的树脂块从剩余的树脂基底上切下，以确保仅有小型树脂块被放入聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）中。该树脂块的总高度不应超过5 mm。
18. 用碳导电胶将树脂块粘附至铝制样品台，确保待成像的一面位于最外侧边缘（图1）。
19. 待胶水完全干燥后，使用Cressington真空蒸发系统在树脂块表面镀上一层薄金（> 20 nm）。

3. 在聚焦离子束/扫描电子显微镜中的成像

20. 在低倍镜下，使用二次电子成像（5 kV，0.5 nAmp），调整样品块方向，使选定的兴趣区域及待成像的样品侧面朝向操作者（图2 c，d）。
21. 调整样品块方向，使待成像的表面与切削离子束平行。此时电子束与该表面成54°角（图2 b）。
22. 使用30 kV、13–27 nAmp的离子束电流，从待成像区域前方去除一条狭窄的树脂带。
23. 切换至背散射电子成像模式，以观察覆盖在兴趣区域上方的切削面。
24. 结合光学显微镜参考图像（步骤16中获取）与切削面图像，定位样品块上需要进一步切削和成像的精确区域（图2）。
25. 利用显微镜的气体注入系统，在兴趣区域上方的样品块表面沉积一层保护性碳层（或金属层），厚度约为1微米（图2）。
26. 使用700皮安（picoAmps）的电流，精细切削最终将用于获取图像的样品区域。
27. 持续使用离子束完全切削该成像面，直至表面不再可见切削伪影。通过在整个视野范围内观察连续图像的变化来判断是否完成充分切削。切削不足的表现为图像中出现垂直的白色条纹或“帘状”伪影。
28. 让显微镜静置至少2小时，以使任何热变化完全消散。这可降低成像过程中样品面漂移的风险，避免图像错位。
29. 设置显微镜参数以进行连续成像。确保电子束电压足够低，仅对样品表面极浅层的材料进行成像，且该成像深度应远小于每次切削去除的表面厚度。典型的成像参数为1.2–2.0 kV的电压，像素尺寸为4–20 nm。像素驻留时间应保持在约10 μsecs，以确保完成一次切削并获取一幅图像的总时间低于2分钟（图3）。

4. 成功的秘诀

步骤 1）确保样品厚度不超过 150 微米。这将有助于各种染料和树脂充分渗透到组织中。可在固定后立即使用振动切片机对样品进行切片以达到此厚度。该厚度适用于脑组织。其他类型的组织需进行测试，以确保固定和染色效果充分。

步骤 3）在加入该次级固定剂时，样本必须在溶液中均匀分散，不能聚集在小瓶的某一区域。这将确保样本得到最大程度的渗透，并减少在固定过程中样本发生变形。在加入溶液后，立即轻轻旋转小瓶内的样本即可实现均匀分散。

步骤15）确保目标区域位于块表面正下方（< 30 微米）处。这将减少图像采集阶段离子束的切削量。

步骤22）离子束的扫描时间需要足够长，以确保整个成像表面被完全铣削。铣削不足将表现为白色条纹，或在成像表面上垂直向下的“帘状”结构。

步骤26）最终铣削的表面必须大于成像区域的表面。这是因为铣削产生的树脂碎屑会从块体中喷出，并重新沉积在块体表面附近。这种再沉积可能侵入成像视野，因此需铣削比成像区域大得多的面积以避免此问题。对于宽度为20微米的成像窗口，铣削后的块体表面宽度应大于30微米。

步骤29）至关重要的是，电子束参数应确保图像由仅从块状样品表面最上层几个纳米范围内出射的电子生成。这可通过将电压降至2 kV以下，并确保没有电子穿透过深来实现。同时，通过在探测器上施加栅极电压，使只有能量最高的电子参与最终图像的形成，也有助于实现这一目标。通常情况下，当成像电压为1.5 kV时，采用1.3 kV的栅极电压。

5. 代表性结果：

图1. 树脂块的制备。a) 在体视显微镜下观察经树脂包埋的成年大鼠脑冠状切片（厚度为80微米）。图像清晰显示了可从该切片中切割出的不同脑区。b) 使用手术刀片切割组织，此处从皮层取下一个1毫米见方的组织块，并(c)将其粘附至空白树脂块上。d) 然后使用安装在超薄切片机上的玻璃刀修整树脂块，当修块至仅保留目标区域时（e），在包埋材料的前表面垂直方向切出一个台阶。f) 随后将整个修整后的区域从其余树脂中切下，并粘附至铝质样品台，以备进行金属镀膜并在扫描电子显微镜中成像。

图 2. 为聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）成像准备块面。a) 和 b) 展示了样品块及其被铣削以形成成像面的边缘示意图（黑色双头箭头所示）。图中显示离子束（白色）平行于成像面，电子束（灰色）以54°角入射到成像面。 c) 为使用电子束并经二次电子成像所获得的样品块视图。在样品块的这一侧，一个较暗的区域（白色虚线框所示）显示了已被粗铣的部分表面（双头黑色箭头所示），以暴露下方的样品。d) 当仅使用背散射电子对该区域成像时，可观察到嵌入的组织。此处，嵌入组织切片的全宽由双头白色箭头标示。c) 中的比例尺为 100 微米。

图3. 使用各向同性体素对脑组织体积进行成像。a) 区域反差的背散射电子图像，显示大鼠脑组织某一区域的超微结构。所有膜结构以及较大的大分子结构均清晰可见。b) 在5 nm间距下共采集1600张图像，生成具有各向同性体素的图像序列。c) 该图像序列可在任意平面上以相同分辨率进行成像。本图展示了同一突触连接在xy平面和yz平面上的成像结果。

讨论

当目标区域不过大时，聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）技术能够达到最佳效果。成像体积的上限取决于离子束及其在数小时内持续稳定铣削的区域范围。目前已有在约60 × 60微米面积上进行操作的实例，但以合适的图像分辨率对整个区域进行成像并不可行，主要受限于采集如此大图像所需的时间。例如，一幅4000 × 4000像素、像素驻留时间为10微秒的图像需要2分40秒才能完成采集；而对于60微米的视场，其像素尺寸仅为15 nm。在对细胞和组织的超微结构进行成像时，更小的像素尺寸更为合适，通常为4至10 nm/像素。若对60 × 60微米的区域以该分辨率成像，即使显微镜具备相应能力，采集时间也将长达10小时。基于上述原因，该显微镜最适合用于成像体积约为10 × 10 × 10微米，或完整细胞中的重要区域。对于经此方法染色对比良好的样品，此类成像可在48小时内轻松完成。

目前，该方案主要应用于脑组织以及贴壁在盖玻片上的各种培养哺乳动物细胞。然而，这种固定和染色步骤也可用于其他多种生物材料，包括植物材料，以获得对比度同样良好的图像序列。

因此，该技术的主要优势在于其能够以各向同性的体素对体积进行成像。此类图像堆栈允许利用堆栈中任意平面上的图像对三维体积进行分析。其优势在于使观察者能够从任意方向观察图像序列中的特征，从而提供更丰富的图像细节（图3）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氰基丙烯酸酯胶水
体视显微镜：Leica MZ8	Leica Microsystems
Durcupan 树脂	Sigma-Aldrich
FIB/SEM 显微镜（Zeiss，NVision 40）
玻璃组织学载玻片	Menzel-Glaser	AA00008032E
玻璃刀制备仪：Leica EM KMR2	Leica Microsystems
玻璃闪烁瓶（20 ml）	EMS	72634
戊二醛	EMS	16222
珠宝商’s 锯	EMS	72010
模具分离剂	Glorex，瑞士	62407445
四氧化锇	EMS	19110
多聚甲醛	EMS	RT 19208
磷酸盐缓冲液用磷酸盐	Sigma-Aldrich	71642 和 71496
二甲胂酸钠	Sigma-Aldrich	20840
带金靶的溅射镀膜仪	Cressington Co.
Tris 碱（TBS）	Sigma-Aldrich	T1378
超薄切片机：Leica UCT	Leica Microsystems
醋酸铀酰	EMS	RT 22451