在光学透明的氧化铟锡电极上构建细胞图案

摘要

通过施加还原电位，从玻璃基底上可单独寻址的氧化铟锡（ITO）电极表面脱附了抗污损的聚乙二醇（PEG）硅烷单分子层。对ITO微电极上的PEG-硅烷层进行电化学剥离，可实现空间可控的细胞黏附，细胞排列模式与电极图案高度一致。

摘要

对细胞表面相互作用实现精确的空间和时间控制，是构建用于体外模拟天然组织的多细胞结构的重要前提。本研究采用光刻和湿法刻蚀技术，在玻璃基底上制备了可独立寻址的氧化铟锡（ITO）微电极。含有ITO微电极的玻璃基底经聚乙二醇（PEG）硅烷修饰，使其具有抗蛋白质吸附和抗细胞黏附的特性。通过使用铁氰化钾作为氧化还原探针分子进行循环伏安法检测，验证了绝缘性PEG分子在电极表面的存在。重要的是，施加还原电位可导致PEG层脱附，从而再生出导电的电极表面，并出现典型的铁氰化钾氧化还原峰。施加还原电位还使ITO电极的性质由抗细胞黏附转变为促进细胞黏附。通过对ITO微电极上的PEG硅烷层进行电化学剥离，可实现空间可控的细胞黏附，细胞排列模式与电极图案高度一致。在这些基底上已成功实现了多种细胞类型的微图案化。未来，利用该方法对生物界面性质的调控能力，可在光学透明基底上将三种或更多种细胞以精确的几何构型组装，从而构建复杂的细胞微环境。 关键词：光刻，湿法刻蚀，氧化铟锡电极，聚乙二醇硅烷，循环伏安法，电化学脱附，细胞微图案化，细胞黏附，生物界面，多细胞结构

方案

第一部分：电极的图形化

1. 将清洁并脱水的氧化铟锡（ITO）镀膜玻璃载玻片涂覆正性光刻胶
2. 在100°C下烘烤表面，以去除光刻胶中的溶剂
3. 烘烤后，使用佳能掩模对准仪，通过掩模对表面进行紫外光曝光
4. 在显影液中去除曝光区域的光刻胶
5. 对表面进行坚膜烘烤，以去除残留的显影液
6. 未被光刻胶图案保护的ITO区域在酸性蚀刻液中被蚀刻去除
7. 通过在丙酮中超声处理去除残留的光刻胶，从而形成ITO电极

第二部分：表面修饰

1. 将修饰电极在等离子体腔室中清洗，并用甲苯中的2% PEG硅烷进行修饰。孵育2小时后，再进行2小时烘烤。

注意：该过程需在充满氮气的手套袋中进行，以避免水分存在，因为 PEG 硅烷对水分具有反应性。

第三部分：电化学

1. 将钢丝连接到电极片上。
2. 将经 PEG 硅烷修饰的电极置于电化学池中，以进行电化学实验。
3. 在 PBS 溶液中，使用三电极系统去除来自相互连接区域的 PEG 硅烷。

第四部分：细胞图案化

1. 将成纤维细胞与新近去除涂层的基底共同孵育。孵育后，这些细胞会附着在PEG硅烷被去除的区域；然而，细胞不会在表面的其他任何位置结合。
2. 将图案化细胞置于新鲜培养基中孵育，并使用显微镜进行观察。

讨论

在本视频中，我们展示了在光学透明的氧化铟锡电极上进行细胞图案化的方法。使用光刻技术制备ITO电极后，将其修饰上一层具有抗细胞黏附性的PEG硅烷自组装单分子层。通过电化学方法使该单分子层脱附，从而将表面从抗细胞黏附状态转变为促细胞黏附状态。本视频展示了小鼠3T3成纤维细胞的图案化结果。我们还利用相同技术实现了肝细胞、原代细胞以及星状细胞的图案化。此外，通过制备多个独立的电极，可将该技术扩展用于多种细胞类型的组装。进一步地，通过控制电极设计的几何形状，可在空间和时间上对细胞进行隔离培养。

光刻和湿法刻蚀技术是标准的微加工工艺。电化学研究在金表面已有广泛报道，但在氧化铟锡（ITO）表面的研究相对较少。除了导电性之外，ITO还具有透明性的优势。使用ITO可使样品通过简单的倒置显微镜进行观察。本视频中介绍的技术可用于在表面以精确的几何图案组装任何类型的细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氧化铟锡	其他	Delta Technologies	CB 40IN
聚乙二醇硅烷	试剂	Gelest Inc.	SIM6492.66
盐酸	试剂	Sigma-Aldrich	320331
硝酸	试剂	Sigma-Aldrich	258121
乙醇	试剂	Sigma-Aldrich	459836
丙酮	试剂	Sigma-Aldrich	650501
甲苯	试剂	Sigma-Aldrich	34866
培养基	试剂	Invitrogen
胶原蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	C3867
3T3 小鼠成纤维细胞	细胞系	ATCC