使用超临界流体色谱法进行纯化的基本原理 - ADVERTISEMENT

摘要

使用超临界流体色谱法 （SFC） 从混合物中分离化合物的基本原理与制备型液相色谱的基本原理相似。

摘要

尽管超临界流体色谱 （SFC） 并不是一项新技术，但随着仪器、软件和化学技术的进步，制备型 SFC 越来越受欢迎。 使用 SFC 分离化合物的基本原理与大规模制备型液相色谱的基本原理相似。 在本研究中，我们说明了流速、样品溶出溶剂和色谱柱选择性对化合物从混合物中分离的影响。 采用最佳柱床密度 （OBD） 技术¹ 填充的色谱柱和匹配的填料可确保从小规模分离到大型制备级分离的简单且可预测的可扩展性。

方案

1. 样品制备

• 化合物混合物 1：香豆素、布洛芬和卡马西平;甲醇中各 20 mg/mL
• 化合物混合物 2：布洛芬和卡马西平;甲醇中各 20 mg/mL
• 化合物混合物 3：布洛芬和卡马西平;DMSO（二甲基亚砜）中各 20 mg/mL
• 化合物混合物 4：10 mg/mL 非诺洛芬、15 mg/mL 酮洛芬、20 mg/mL 黄酮、20 mg/mL 布洛芬和 20 mg/mL 香豆素的甲醇溶液

2. 实验条件

1. 在沃特世方法工作站SFC系统上进行分析色谱分析。
   色谱柱：Viridis SFC 2-乙基吡啶色谱柱，5 μm，4.6 × 150 mm，部件号186004937。
2. 在Waters Prep 100 SFC UV定向系统上进行制备色谱。 这 列：
   • Viridis SFC 2-乙基吡啶 OBD 色谱柱，5 μm，19 × 150 mm，部件号 186004945
   • Viridis SFC 硅胶 OBD 色谱柱， 5 μm， 19 × 150 mm， 部件号 186004918
   • Viridis SFC 2-乙基吡啶 OBD 色谱柱，5 μm，19 × 100 mm，部件号 186004944
3. 其他方法参数：
   • 柱温：40 °C
   • 助溶剂：甲醇
   • 进样体积、流速和梯度：以数字形式报告

3. 代表性结果

流速

制备型液相色谱分离中使用的流速受多种因素的限制，包括色谱柱的长度和直径、粒径和系统背压。 低粘度二氧化碳是 SFC 中流动相的主要成分，可以使用比液相色谱中通常使用的流速更高的流速。 与色谱柱长度相关的反压也较低，因此可以使用更长的色谱柱来提高分离度。 更高的流速通过减少完成分离的时间来提高通量。 如图 1 所示，如果梯度斜率（以单位柱体积变化百分比表示）保持不变，则不同流速下的色谱曲线相同。 这是通过减少运行时间来实现的，其比例与流速的增加相同。

样品溶出和上样溶剂

从混合物中分离化合物要求样品在进样前完全溶解。 甲醇是 SFC 中最常见的助溶剂，在典型制备级分离通常所需的高浓度下，甲醇不能溶解所有样品。 大量溶剂（如甲醇）会限制色谱柱的质量容量，因为强烈的溶剂效应会使色谱图变形。 改性剂流进样是所有 Waters 制备型 SFC 系统的标准专利配置，旨在减少这种溶剂效应。二甲基亚砜 （DMSO） 经常用于纯化实验室，以溶解许多不同类型的化合物。 图 2 和图 3 说明了与甲醇中进样的样品相比，SFC 中 DMSO 进样如何为非手性应用带来更高的上样量和更好的分离度。

注意：对于手性应用，应考虑谨慎使用，因为 DMSO 会严重损坏传统的包被手性固定相。 如果样品溶解度需要 DMSO，则应选择固定化手性色谱柱。

选择性

在 SFC 中，会定期测试多根色谱柱，以确定哪种色谱柱能为混合物中的组分提供最佳分离度和峰形。 化合物之间的良好分离度可实现高纯度的目标化合物的分离。 在下面的示例中，2-乙基吡啶色谱柱对样品混合物中的所有五种化合物均表现出出色的分离效果。 在硅胶柱上分析的相同样品混合物仅显示三个组分峰，因为它具有不同的选择性。 香豆素和布洛芬在约 0.8 分钟时共洗脱，黄酮和非诺洛芬在稍晚时共洗脱。 黄酮和布洛芬也会改变硅胶柱上的洗脱顺序。 酮洛芬与两列上的所有其他峰分离良好。

缩放

粗品样品混合物通常采用筛选梯度进行分析，该梯度在相对较短的时间内从较低百分比的有机溶剂开始，到较高百分比的有机溶剂结束。 如果目标化合物分离良好，则可以直接缩放梯度以进行纯化。 当所有化合物在梯度完成之前洗脱并完全分离时，简单地缩短梯度长度是可以接受的。 SFC采用的快速流速与改进的梯度相结合，大大缩短了目标化合物纯化所需的总时间。

缩放分离需要匹配色谱柱填料和粒径，以及适当缩放的进样体积和梯度。Waters 制备型 SFC 色谱柱采用 OBD 技术填充，可确保出色的柱床稳定性以及与 Waters 分析 SFC 色谱柱相当的性能。 OBD 制备柱的填充柱床密度与等效分析柱非常匹配。 这种创新程序生产的制备柱具有优异的稳定性、重现性和效率。

在小规模下进行上样研究，以确定色谱柱上可以上样多少样品。 目标是在不影响分辨率的情况下最大化负载。 更高的峰分离度可使分离化合物的上样量更高，纯度更高。 较高的色谱柱上样量减少了获得足够材料用于后续实验所需的运行次数。 上样研究的色谱如图 5 所示。 保守的 35 μL 进样体积在混合物中的所有化合物之间显示出良好的分离度，随后在大色谱柱上进行缩放以进行制备型运行。 在 19 × 150 mm 制备型 SFC 色谱柱上进样总体积为 600 μL。 图 6 比较了在最大上样量下使用小规模改性梯度的色谱图与用于分离的大规模色谱图。 选择性相同，这是使用分析色谱作为分离和纯化的侦查工具时的关键因素。分析型色谱图和制备型色谱图之间的保留时间和分离度差异可归因于系统体积和进样模式等因素。特别是，所有沃特世制备型 SFC 系统均采用获得专利的改性剂流进样模式*，可最大限度地减少溶剂效应，从而提高通量和效率><。 *美国专利 # 6,576,125

讨论

• 液相色谱的基本原理可应用于超临界流相色谱（SFC）。
• 超临界流相色谱可以以更高的流速运行，从而加快分离速度并提高通量。
• 溶解度有限的样品可以溶解在二甲基亚砜中，并使用 SFC 纯化。 使用 DMSO 进行样品溶解，可减少与样品溶解度相关的不确定性，从而使纯化过程更加容易。
• 与溶解在甲醇中的相同样品相比，溶解在DMSO中的样品的分辨率和上样量可以得到改善。 更好的样品分辨率导致产品纯度更高。 更高的负载提高了纯化过程的效率。
• 色谱柱选择性会影响混合物组分的分离。 使用快速梯度筛选不同的色谱柱可以决定使用哪种制备色谱柱来分离样品中的化合物。
• 分析色谱柱和制备型OBD色谱柱之间的扩展能力导致在小规模和大尺度上实现相同的分离，前提是进样体积、斜率和梯度时间正确缩放，并且化学成分和粒径保持恒定。 色谱柱的可扩展性消除了峰鉴定的不确定性，从而促进了更高的纯化过程效率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
方法站 SFC 系统	Waters	有关更多信息，请访问 www.waters.com	分析型 SFC
SFC-UV Prep 100	Waters	有关更多信息，请访问 www.waters.com	制备型 SFC 系统
Viridis™SFC 2-乙基吡啶，4.6 x 150 mm，5 &μ;m 色谱柱	Waters	186004937	分析型 SFC 色谱柱
Viridis™SFC 2-乙基吡啶 OBD™， 19 x 150 mm， 5 μm 色谱柱	Waters	186004945	制备型 SFC 色谱柱
Viridis™SFC 二氧化硅 OBD™， 19 x 150 毫米， 5 μm 色谱柱	Waters	186004918	制备型 SFC 色谱柱
Viridis™SFC 2-乙基吡啶 OBD™， 19 x 100 mm， 5 &μ;m 色谱柱	Waters	186004944	制备型 SFC 色谱柱

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