评估小鼠的挖掘、筑巢和贮食行为

摘要

掘洞、筑巢和贮食是小鼠在实验室中易于表现的物种典型行为。本文介绍了如何以简便且低成本的方法对这些行为进行评估。这些实验方案对小鼠品系、脑损伤及疾病状态极为敏感。此外，这些行为测试本身为小鼠提供了“环境丰富化”，体现了“3R原则”中的“优化（Refinement）”环节。

摘要

执行“日常生活活动”（ADL）能力的下降是阿尔茨海默病（AD）的早期征兆。目前针对AD潜在治疗方法的临床前行为筛查主要集中于认知功能测试，而这类测试通常需要昂贵的设备并耗费大量实验人员时间。然而，人类的情景记忆（AD中受损最严重的记忆类型）与啮齿类动物的记忆存在本质差异，后者似乎基本不具备情景记忆特征。因此，当前在啮齿类动物中筛选新型AD治疗方法的策略本质上难以取得成功。一种新的临床前筛查思路是表征小鼠的日常生活活动能力（ADL）。幸运的是，牛津大学近期已开发出多种此类检测方法，本文将介绍其中最敏感且特征最明确的三种方法。

掘穴行为实验最初在牛津大学开发¹³。该实验源于建立小鼠贮食模型的需求。大多数已发表的啮齿类动物贮食模型都需要将远离笼舍的食物源通过一条连接通道与家笼相连。这种方法需要改造家笼，同时建造防鼠的连接通道和食物源。因此，研究人员考虑是否可以将食物源直接放置于笼内。研究发现，若将容器置于笼底，次日清晨容器通常已被清空。然而，食物颗粒仅被堆放在容器入口处，而非像真正贮食行为那样被搬运至远离容器的特定位置。进一步观察发现，小鼠实际上是在进行挖掘（“掘穴”）动作，而非用嘴将颗粒搬运至选定地点，这表明其行为并非真正的贮食行为⁶。

食物颗粒并非挖掘行为的必要底物；小鼠会将装有沙子、碎石甚至来自自身笼子的脏垫料的管子清空。此外，即使在旁边放置一个空管，它们也会将装满的管子清空⁸。

文献中存在多种嵌套实验方案。目前牛津方案简化了操作流程，并具有明确定义的巢穴质量评分系统⁵。

后来开发了一种囤积行为范式，其中小鼠不再返回真实的笼舍进行囤积，而是被适应性地饲养在囤积装置的“起始区”内。该起始区连接一根由金属网制成的管道，管道远端放置食物来源。只要将小鼠适应为白天生活在“起始区”，仅在夜间才允许其进入囤积管道，这种设置就能获得良好的囤积行为表现。

方案

1. 挖掘行为

1. 仪器设备

尝试了多种容器设计（例如可轻松清洗的金属壶，但小鼠不愿进入其中）。最终发现，使用一段房屋排水槽连接用的塑料落水管，将其一端略微抬高以防止食物颗粒意外（非故意）移位，并将另一端封闭，是一种高效的装置。目前的掘穴装置由直径68 mm的塑料落水管制成，截成20 cm长的段（图1）。一端用12 mm中密度纤维板（mdf）塞子封闭。（操作mdf时建议佩戴呼吸防护设备）。为便于清洁和防水，可在mdf的内外表面涂覆防水胶状密封剂，同时也用于将其粘合至掘穴管中。使用5 cm长的机械螺钉将管子的另一端抬高至离地面3 cm。在掘穴管开口端1 cm处钻两个相距90°角的孔，并插入螺钉拧紧⁴。

洞穴的直径可能至关重要；Schmid-Holmes 等人¹⁹观察到，野外的小鼠主要从与我们人工洞穴大小相似的洞穴中进行“清理挖掘”。

图1. 一只小鼠在掘穴管中。

2. 实验步骤

1. 适应期
   挖掘行为通常是自发的，但其中存在一定学习成分。这种学习过程可通过社会促进作用得到增强。因此，在将要接受处理测试的小鼠群体饲养笼中，提前一晚放入一个完整的挖掘管。每个挖掘管中装入200 g通常作为日常饮食的饲料颗粒（指致密压缩型饲料；若使用“膨化”型饲料，则挖掘管所能容纳的重量将少于200 g）。实验人员在选择挖掘基质时应考虑此类因素。
   
   若小鼠处于食物限量饲养状态（例如，为了激励其完成并行的迷宫学习任务），可使用非食物类物质替代，例如室内盆栽土壤表层常用的黏土球、豌豆砾石（直径约1 cm的小石子）或沙子。由于豌豆砾石和沙子的密度约为饲料颗粒的三倍，若小鼠挖掘行为非常剧烈，使用这些材料可有效避免出现“天花板效应”，是饲料颗粒的良好替代物。
2. 基线测定
   在给予处理前，应以与处理后测试完全相同的方式，间隔48小时进行（最好两次）基线挖掘测试。如果小鼠饲养在0700–1900 h的明暗循环环境中，测试最好在约16:00开始。这一时间点较为敏感，因为此时小鼠通常尚未觉醒，挖掘行为启动较慢，不像在黑暗期充分活跃时那样迅速。开始测试2小时后，进行一次“快照式”测量，记录已被挖掘的饲料重量：将挖掘管内容物倒入已去皮重的容器中称重，随后将饲料颗粒重新装回挖掘管并放回笼中。若小鼠仍在管内，可轻柔地将其与内容物一同倒入称重容器，称重后将小鼠放回笼中。通过从初始200 g中减去剩余重量，计算出2小时内被挖掘的饲料重量。次日早晨进行最终读数，此时时间并不关键，因为小鼠通常已返回睡眠状态（常在挖掘管内），不再进行主动挖掘。使用第二次测试中获得的2小时测量值，根据基线表现对动物进行均衡分组。由于挖掘行为会随着练习而增强¹⁷，基线测定也有助于小鼠达到更稳定的渐近表现水平，从而更清晰地揭示处理效应。
3. 测试阶段
   在给予处理后，对小鼠进行与基线测定阶段完全相同的挖掘测试。若需长期重复使用该挖掘测试，建议每次测试之间至少间隔48小时，以防止因操作过度暴露而导致行为表现下降。
4. 注意事项
   切勿将散落在笼底的已挖掘饲料重新放回挖掘管中。即使小鼠未进行任何挖掘，也应照常执行称重程序；称重操作本身造成的干扰往往会刺激小鼠行为，而已部分挖掘基质的小鼠在称重过程后通常会以更强的活力重新开始挖掘。

2. 预期结果

C57~BL/6小鼠在前两小时内通常挖掘约70 g，过夜则接近200 g。海马病变小鼠的挖掘量通常少于5 g¹¹（图2）。朊病毒病会抑制挖掘行为^1,2，脂多糖给药同样具有抑制作用²⁰。在注射患病脑组织匀浆后10至12周，挖掘行为即可检测到朊病毒病（羊瘙痒症），而临床症状直到22周才出现¹³（图3）。研究表明，挖掘行为对菌株差异¹⁵以及钾离子通道亚基的基因敲除¹⁰具有敏感性。

图2. 对照组与海马损伤小鼠在两小时内挖掘的食物颗粒重量（中位数及四分位距）。后者挖掘的食物重量显著低于对照组（P = 0.0001）。

图3. 对照组与感染朊病毒小鼠夜间挖掘的食物颗粒重量（均值）。两组小鼠在注射后第7至10周的挖掘行为均随训练而增加，但从第12周开始，朊病毒组的挖掘行为下降，且组间差异具有统计学意义（超过两个标准误）。

3. 讨论

我们已在其他啮齿类动物物种中测试了掘洞行为——包括大鼠、沙鼠、仓鼠和埃及多刺鼠⁸。除最后一种外，其余物种均可被诱导挖掘大量陆地基质（如碎石或沙子），但对食物颗粒的挖掘量则显著较少，即使在长期接触陆地材料之后亦如此。这种与小鼠的差异原因尚不清楚。在完成本项工作后，人们发现埃及多刺鼠在野外实际上并不挖掘洞穴；它们可能占据沙鼠挖掘的洞穴，且其自然栖息地的地表常为坚硬岩石。最近在内罗毕的观察显示，在多刺鼠属（Acomys）中，野生状态下会掘洞的威尔逊多刺鼠（Acomys wilsoni）和珀西瓦尔多刺鼠（Acomys percivali）在实验室中也表现出掘洞行为。

4. 筑巢

1. 仪器设备

该实验在单独的笼子中进行，可使用与挖掘实验相同的笼子。笼底应铺有正常垫料，厚度为0.5 cm（垫料厚度的变化或过厚的垫料可能会影响筑巢行为）。每个笼子需提供一个“Nestlet”垫料块，即一块5 cm见方的压缩棉絮（Ancare公司产品）。

2. 实验步骤

小鼠在暗周期开始前约一小时被单独放入筑巢笼中，次日早晨进行结果评估。与掘穴实验类似，出于相同原因，时间安排并非关键。

3. 评分

巢穴按5分制进行评估（图4-8），同时称量未撕碎的Nestlet材料的重量⁵。

1. 筑巢材料基本未被触动（>90%保持完整）。
2. 筑巢材料部分被撕碎（50–90%保持完整）。
3. 筑巢材料大部分被撕碎，但通常无法辨认出明确的筑巢区域：< 50%的筑巢材料保持完整，且< 90%的材料分布在笼底四分之一面积内，即棉花未聚集成巢，而是散落在笼内各处。注意：材料有时可能位于大致定义的巢区范围内，但关键判断标准是50–90%的材料已被撕碎。
4. 可识别但较扁平的巢：> 90%的筑巢材料被撕碎，材料聚集在笼底四分之一面积内形成巢状结构，但巢较扁平，其边缘高度超过小鼠蜷缩时身体高度的部分不足周长的50%。
5. （接近）完美的巢：> 90%的筑巢材料被撕碎，巢呈火山口状，其边缘高度超过小鼠身体高度的部分占周长50%以上。

当各项标准不一致时，取其折中值。例如，一个结构完美的鸟巢内含一片未撕碎的0.7克材料，评分为4.5。

图4. 巢评分1

图5. 巢评分2

图6. 巢穴评分3

图7. 巢穴评分4

图8. 巢穴评分5

4. 预期结果

雄性和雌性均会筑巢，因为筑巢的目的不仅是体温调节，还与繁殖相关。对于C57BL/6小鼠而言，雄性和雌性的筑巢评分处于相同范围内，尽管我们尚未在单次实验中进行受控比较。大多数C57BL/6小鼠的筑巢构建评分为4-5分，但当海马体受损时，其中位评分约为1-2分；评分超过3分的情况极为罕见（图9）。此外，筑巢行为在朊病毒疾病发生约10-12周时即表现出敏感性^1,2,16.

图9. 对照组小鼠与背侧、腹侧及全海马损伤小鼠的筑巢评分（中位数及四分位距）。仅全海马损伤小鼠表现出筑巢行为的抑制，因此选择性损伤背侧和腹侧区域的效果似乎低于阈值，但具有叠加效应。

5. 贮藏行为

1. 仪器设备

一系列“家园基地”连接着由金属网制成的管道，管道远端永久封闭，用于放置食物颗粒，近端则通过木塞暂时封闭。此设计用于防止小鼠在适应家园基地之前进入管道7。

该装置（图10）可通过多种方式制作，只要遵循基本原理即可。我们的装置由8个木箱成一排组成，每个木箱尺寸为30 × 13 × 15 cm，并配有透明的有机玻璃盖。每个木箱均配备一个水瓶，并在后部设有一个孔，用于插入围挡管。管道由黑色塑料制成，长10 cm，直径40 mm，连接一段金属网管，网管长45 cm，直径4 cm，整体总长度为50 cm。金属网孔为13 mm见方，采用双层卷绕方式，且网格错位排列，以减小网孔尺寸，防止饲料颗粒掉落。若可获得6 mm见方的网格材料，则更为理想，因单层即可满足要求。管道远端（放置饲料颗粒的一端）为封闭状态，近端则用一个可拆卸的木塞密封。

图10. 贮藏管中的小鼠

2. 实验步骤

1. 通常情况下，首次进行贮食行为时个体差异较大，有些小鼠可能完全不表现出贮食行为。与掘洞行为类似，贮食行为会随着练习而改善。因此，在实验设计允许的情况下，最好在给予处理前先进行基线期测试。
2. 在白天较早时段将每只小鼠放入各自的实验箱中以适应环境。箱内放置一个纸板隧道，该隧道应已在真实的群体饲养笼中放置至少一晚，同时加入足量的污染垫料，以使其感觉更像“家”。使用木塞封闭贮食管入口，防止小鼠在傍晚前进入。将100 g饲料颗粒（大小颗粒混合）从贮食管另一端垂直倒入，使其位于贮食管远端。为确保小鼠在测试开始前处于轻度饥饿状态，不在其居住箱内提供食物。
3. 在暗期开始前，移除木塞，允许小鼠进入贮食管。次日早晨（时间点并非关键）收集并称量所有被贮藏到居住箱中的饲料颗粒。

6. 预期结果

使用雌性 C57BL/6 小鼠时，贮藏食物的中位量约为 50–70 g。海马体损伤会显著抑制贮藏行为11，而前额叶皮层损伤仅产生轻微影响¹² (图11).

图11. 对照组与内侧前额叶皮层损伤小鼠囤积的食物颗粒重量（中位数及四分位距）。尽管两组中位数差异较大，但对照组的高度变异性导致结果远未达到统计学显著性（P = 0.3）。

讨论

这些实验操作极为简便，但效应量非常大，因此对处理因素、品系差异等极为敏感，符合罗素（Russell）和伯奇（Burch）提出的“3R原则”中的“优化”（Refinement）原则¹⁸。事实上，动物在掘穴等行为测试中的良好表现似乎能够反映其整体健康状况良好，因此该测试可作为评估动物福利的有效方法。

如今，人们已充分认识到环境丰富化对实验啮齿类动物的重要性。在许多动物房中，提供筑巢材料已成为常规做法，且易于实施。小鼠热衷于挖掘洞穴的行为表明，挖掘活动可能是一种极佳的环境丰富化方式，但遗憾的是，目前尚未开发出可“自动补充”的洞穴装置以方便实际应用。至于小鼠是否能从贮藏行为中获得丰富化效应，仍有待确定。

一个缺点是，这些测试生成的数据通常为非参数性数据（分布不符合正态分布），因此需要采用适当的非参数统计方法进行分析，例如成组比较时使用曼-惠特尼U检验，多组数据比较时使用克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析。如果采用重复测量设计，由于没有适用于非参数数据的方差分析方法，可对结果进行转换，例如通过平方根或对数转换，使其分布更接近正态分布。

仪器的测量值可能与文中所述规格略有差异（对美国实验者较为适用），但应避免存在较大差异。然而，在某些情况下，其他实验者可能会发现与本文所述不同的构造效果更佳。

对于所有行为学测量而言，应检测小鼠的活动水平是否正常，因为不活动会明显对物种典型行为产生不利影响。当感染朊病毒的小鼠表现出挖掘和筑巢能力受损时，其活动水平仍保持正常（通过开放场地装置检测）。事实上，在这些物种典型行为首次出现障碍后的约2至4周，小鼠会出现一段活动过度期²。

海马损伤对挖掘、筑巢和贮食行为（均为物种典型行为）造成的严重损害，与该损伤对空间学习和记忆功能的损害相一致，后者是此类损伤早已确立的效应¹⁴。这些行为缺陷似乎相当于阿尔茨海默病（AD）患者日常生活能力受损的典型表现。

这些物种典型的行为测试在阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病的临床前治疗筛选中可能具有重要用途¹⁴。在许多人类脑部疾病中，执行日常正常任务的能力丧失或下降，其重要性与认知功能障碍等其他疾病特征相当。特别是这种能力的丧失可能需要照护者的介入，从而常常带来巨大的社会经济负担。