竞争性归巢实验可直接在单个小鼠体内评估两种不同细胞群体的迁移特性。本文通过比较体外生成的肠道趋向性T细胞与非肠道趋向性T细胞的迁移能力，说明该实验方法。
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摘要
摘要
为了发挥其功能，淋巴细胞需要离开血液并迁移至体内的不同组织。淋巴细胞与内皮细胞的黏附及其组织外渗是一个多步骤过程，由淋巴细胞表面表达的不同黏附分子（归巢受体）及其在内皮细胞上表达的相应配体（地址素）共同调控1 2。尽管这些黏附受体的功能可在一定程度上通过离体（ex vivo）实验进行研究，但评估其在体内（in vivo）淋巴细胞黏附与迁移过程中生理相关性的最终标准，是观察它们在活体环境中的作用。为此，已有两种互补的实验策略被广泛应用：活体显微技术（IVM）和归巢实验。尽管活体显微技术对于实时、在不同组织中精确解析特定黏附受体在黏附级联反应中的作用至关重要，但该方法耗时且劳动强度大，通常需要建立复杂的外科手术技术，还需预先分离出均一的细胞群体，并且每次实验仅能分析一个组织或器官。相比之下，竞争性归巢实验能够在同一只小鼠体内直接且同时比较两种（甚至更多）细胞亚群的迁移能力，并允许在单次实验中对多种组织及大量细胞进行分析。
本文描述了一种经典的竞争性归巢实验方案，用于评估特定细胞类型相对于对照细胞群体归巢至特定组织的能力优势或劣势。我们选择展示肠道趋向性T细胞与非肠道趋向性T细胞的迁移特性，因为肠黏膜是人体与外界环境接触面积最大的表面，也是迁移机制研究最为清晰的淋巴外组织。此外，近期研究已证实，维生素A代谢产物全反式维甲酸在调控T细胞肠道趋向性中发挥关键作用。转 视黄酸（RA）是诱导淋巴细胞表达肠道特异性黏附受体（整合素 α4β7 和趋化因子受体 CCR9）的主要分子机制。因此，我们能够高效地生成大量具有肠道趋向性和非肠道趋向性的淋巴ocytes 离体通过在有或无视黄酸（RA）的条件下激活T细胞，最终可用于本文所述的竞争性归巢实验。
方案
1. 离体 肠道归巢T细胞与对照T细胞的制备（见图1）
- 通过研磨一只野生型小鼠的脾脏来分离脾细胞。将细胞悬液重悬于 PBS 中，以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，通过将细胞沉淀重悬于 4 mL ACK 裂解缓冲液中 2–3 分钟以裂解红细胞。随后加入 5 mL PBS，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将总脾细胞以 1 × 106/mL 的浓度重悬于 IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-巯基乙醇 + 青霉素/链霉素（完全 IMDM）中。将细胞分为两组，其中一组添加全反式维甲酸（RA）或合成的维甲酸受体激动剂（如 Am80 或 Am580），终浓度为 100–200 nM 3。在 RA 或 RAR 激动剂存在下激活的 T 细胞将上调 α4β7 和 CCR9 表达，从而转化为肠道趋向性 T 细胞；而在无 RA 条件下激活的 T 细胞则作为对照 T 细胞。
- 将 1.5–2.0 mL 细胞悬液加入已预先包被抗 CD3（10 mg/mL）和抗 CD28（10 mg/mL）的 24 孔板各孔中，在 37°C、5% CO2 条件下孵育（包被方法：每孔加入 500 μL 含抗 CD3 和抗 CD28 的 PBS 溶液，37°C 孵育 2 小时，随后用 2 mL PBS 洗涤两次）。
- 为避免 T 细胞过度刺激，在培养 2–3 天后，将细胞悬液转移至新的未包被的 24 孔板中，继续孵育 2–3 天。根据细胞密度和增殖情况，培养基可能变酸（变黄），此时可更换一半培养基为新鲜的完全 IMDM。从第 0 天起计，培养 4–5 天后收集细胞。
- 通常每孔可获得 1–2 × 106 个效应 T 细胞。因此，为获得每种条件下 10–20 × 106 个 T 细胞，至少应接种 9–12 孔肠道趋向性 T 细胞和对照 T 细胞。
2. 活化T细胞上肠道归巢受体的分析
培养 4-5 天后，我们应观察到在视黄酸（RA）或 RAR 激动剂存在下激活的 T 细胞高表达归巢于肠道的受体 a4b7 和 CCR9，而对照组 T 细胞则应表达极低水平的这些受体4。
流式细胞术（FACS）分析。
- 收集 0.2–0.5 × 106 个细胞，在 4°C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
- 在避光条件下，于 4°C 用抗-CD4-FITC、抗-a4b7-PE（BD Biosciences）、抗-CCR9-APC（eBiosciences）和抗-CD8-PercP孵育 15 分钟。
- 孵育后，在 4°C 下以 300 × g 离心 5 分钟。洗涤细胞并重悬于染色缓冲液中，通过 FACS 分析。
3. 使用CFSE和CMTMR细胞示踪剂标记T细胞
- 实验开始前将所有溶液置于 37°C 环境中。用 PBS 洗涤肠道趋向性 T 细胞（a4b7HighCCR9High）和对照 T 细胞（a4b7Low/Neg CCR9Low/Neg）两次，以去除血清。用 PBS 将 T 细胞浓度调整至 10-15 × 106/mL。
- 向肠道趋向性 T 细胞和对照 T 细胞中分别加入 CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯）或 CMTMR（氯甲基苯甲酰氨基四甲基罗丹明）荧光染料，终浓度分别为 5 mM 和 10 mM，轻轻涡旋混匀后于 37°C 孵育 20 分钟。建议在同一次或另一次实验中交换两种细胞的荧光标记，以排除荧光染料对 T 细胞迁移可能产生的内在影响。
- 孵育结束后，加入等体积的 FBS 终止反应，并在室温下孵育 1-5 分钟。用预热的 PBS 稀释 10 倍后，以 300 × g 离心 5 分钟。用 PBS 洗涤两次，重悬于完全 IMDM 培养基中。
- 理想情况下，将每种 T 细胞群体各 10-20 × 106 个细胞按 1:1 比例混合，然后以 300 × g 离心 5 分钟。最后将细胞重悬于 200-250 µL 预热的 PBS 中，通过尾静脉注射。
- 为计算确切的输入比例（理想值接近 1），保留 5-10 µL 注射用细胞悬液，加入 300 µL PBS 稀释后，通过流式细胞术（FACS）进行分析。
4. T细胞归巢分析
尽管可以在不同时间点（T细胞注射后1小时至数天）分析小鼠，但肠道趋向性T细胞的归巢现象在注射后12-24小时之间记录最为准确。更长的时间点会增加其他变量对最终细胞数量/比例的影响，例如T细胞凋亡以及T细胞从组织中迁移出去。在处死小鼠后，应立即分离多种组织的单细胞悬液，以减少细胞死亡，避免影响最终的细胞得率和实验结果。感兴趣的组织包括小肠、结肠、脾脏、淋巴结、派伊尔斑、肝脏、肺脏和血液。如果注射的T细胞确实是真正的肠道趋向性T细胞，其归巢至小肠黏膜的效率应比对照T细胞平均高出5-10倍或更高。然而，其他组织如血液和脾脏不应表现出T细胞的优先迁移。从小肠固有层和上皮内区室分离淋巴细胞的方法此前已有描述5。
- FACS 染色：根据收集的细胞数量将样本重悬，细胞密度不超过 3.0 x 106 细胞/毫升。如果使用同源CD45.1+ 或 Thy1.1+ 小鼠被用作受体，细胞经相应的同源标志物（如 CD45.2 或 Thy1.2）染色，并联合某些谱系标志物（如 TCRβ链、CD4、CD8、CD45.1）进行标记+/CD45.2+).
- 在FACS分析过程中，首先根据同源标志物（如CD45.1）对细胞设门，然后根据特定谱系标志物（如CD4/CD8）设门，进而分析CMTMR与CFSE阳性细胞之间的比例。
- 数据通常以归巢指数（Homing Index, HI）表示, 其计算方法为：每种组织中的 CFSE/CMTMR（或 CMTMR/CFSE）比值除以相应的输入比值（见下文）。若输入比值接近 1，则组织中的比值等同于 HI。
HI = CFSEtissue / CMTMRtissue : CFSEinput / CMTMRinput
还应分析血液，以确定两种T细胞群体在循环中是否均等存在，或其中一种T细胞群体相对于另一种是否减少（例如，由于在肺/肝脏中优先滞留，或由于存活能力下降）。在比较初始T细胞或静息记忆T细胞与近期活化的效应T细胞时，可能会出现这种情况，因为后者可能在肺部滞留程度更高。如果血液中的同源指数（HI）显著不同于1，则可通过血液中的HI对组织中的HI进行归一化处理。血液可通过心脏穿刺从小鼠中获取（小鼠在安乐死前已用戊巴比妥或异氟烷麻醉），并在用于FACS染色前应用ACK缓冲液裂解两次。
血液归一化 = HI组织 / HI血液
5. 典型结果
受体小鼠（Thy1.1+）在细胞注射后18小时被实施安乐死。从小鼠脾脏、外周淋巴结（PLN）、肠系膜淋巴结（MLN）和小肠固有层（LP）制备单细胞悬液。随后对细胞进行Thy1.2和CD8染色，并通过FACS分析，设门圈选活的Thy1.2+CD8+细胞，进一步计算CMTMR+细胞（肠道趋向性T细胞）与CFSE+细胞（对照T细胞）的比例，并除以输入时的比例进行归一化。结果可如图2所示展示，其中可见肠道趋向性T细胞与对照T细胞向脾脏归巢的程度相当（归巢指数接近1，以红线标示）。相比之下，肠道趋向性T细胞向固有层（LP）的迁移效率约为对照T细胞的10倍。
图1：肠道嗜性与非肠道嗜性T细胞的生成与标记示意图。 从野生型小鼠中分离T细胞，并使用抗CD3/抗CD28抗体激活，同时在含有或不含100-200 nM全反式视黄酸的条件下进行培养。转 视黄酸（RA）。经RA处理4-5天后，T细胞获得表达肠道归巢受体CCR9和α4β7的能力。随后，将具有肠道趋向性的T细胞与对照T细胞分别用CFSE或CMTMR进行差异标记，洗涤后按1:1比例混合，通过尾静脉注射至受体小鼠体内。部分标记细胞用于测定CFSE/CMTMR输入比例（应接近于1）。
图2：归巢分析示例。 在T细胞注射后12-18小时分析小鼠，并从目标器官获取单细胞悬液。细胞经抗Thy1.2（同源标志物）和抗CD8抗体染色后，通过流式细胞术分析各组织中Thy1.2+CD8+ T细胞中CMTMR+与CFSE+细胞的比值。将各组织的CMTMR/CFSE比值除以输入（Input）样本的CMTMR/CFSE比值，得到归巢指数（Homing Index, HI）。本示例中，CMTMR+和CFSE+细胞分别为趋向肠道的效应T细胞和对照效应T细胞。
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讨论
尽管归巢实验能够提供关于特定组织中总体细胞群体迁移的非常有价值的信息，但应当注意的是，这些实验并未直接分析内皮细胞黏附，因此无法区分特定归巢受体在多步骤黏附级联反应（如初始黏附/滚动、活化或牢固黏附）中的具体作用环节。确定归巢受体在黏附级联中特定功能的金标准是活体显微镜技术（IVM），该技术可实时直接观察单个荧光标记的T细胞（或其他细胞，甚至荧光标记的微珠）与内皮细胞的相互作用。然而，IVM耗时较长，需要对小鼠进行麻醉，涉及繁琐的外科手术操作，并且在标记和注射前需预先分离大量纯度高且均一的细胞群体。此外，某些组织（如中枢神经系统（CNS）和胸腺）难以通过IVM进行观察。最后，IVM实验需要固定组织，而肝脏、肺和肠道等部分器官/组织难以实现有效固定（关于IVM的详细讨论参见参考文献6）。
另一方面，归巢实验相对容易建立，可以通过共注射两种不同标记的T细胞群体进行竞争性实验，并且能够通过流式细胞术（FACS）在单次实验中同时检测多个组织/器官和细胞群体。在竞争性归巢实验中，目的是确定一种T细胞群体相对于另一种（不同标记的）T细胞群体在不同组织中的相对迁移能力。由...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
EJV 获得美国克罗恩病与结肠炎基金会（CCFA）的基金资助。JRM 获得来自 CCFA、癌症研究所（CRI）、霍华德·H·古德曼（MGH）、马萨诸塞州生命科学中心（MLSC）以及 NIH 院长新创新者奖的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>动物：C57BL/6小鼠常用于T细胞分离。此外，CD45.1和Thy1.1同源品系可从杰克逊实验室（Bar Harbor, ME）获得。 | |||
| <强>培养基: <强>IMDM （伊斯基沃’s 改良杜尔贝科培养基’s 培养基 + L-谷氨酰胺 + Hepes）加 10% <强>热灭活胎牛血清 （胎牛血清，低内毒素，Gibco）®，Invitrogen，Carlsbad，CA）中，并添加100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素（HyClone Antibiotics，Waltham，MA）、0.5 mg/ml两性霉素B/抑菌素（Gibco）和50 mM β-巯基乙醇–乙醇。 | |||
| <强>ACK红细胞裂解缓冲液（红细胞，10 mM KHCO₃）3，150 mM NH4Cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0），调节pH至7.2–7.4，并于室温保存。 | |||
| <强>PBS （磷酸盐缓冲液，Hyclone，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆） | |||
| <强>流式细胞术（FACS）培养基(PBS 或 IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA)。使用 Selectin-Fc 融合蛋白进行染色时，应采用含 2 mM Ca 的培养基++ 所有步骤（包括流式细胞术数据采集）均应使用IMDM培养基。 | |||
| <强>T细胞标记与过继转移：CFSE（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯）， <强>CMTMR Molecular Probes 公司的 ((5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲酰基)氨基)四甲基罗丹明)®，Invitrogen，Carlsbad，CA）。1000倍储存液应使用DMSO配制（5 mM） <强>CFSE，20 mM <强>CMTMR) 并于 -20 保存°C. | |||
| <强>多克隆T细胞激活24孔板或96孔板 <强>(经组织培养处理的聚苯乙烯平底带盖培养板（BD Falcon，Franklin Lakes, NJ）在37℃孵育2小时°分别用含有抗CD3和抗CD28抗体（各10 mg/mL）的50 mL PBS包被培养板。随后，用PBS洗涤培养板两次，并立即用于T细胞培养。或者，可使用包被有抗CD3/抗CD28抗体的Dynabeads（Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA）替代包被在板上的抗体来激活T细胞。 | |||
| <强>流式细胞术（FACS）染色： 多克隆激活： <强>CD3 (1452C11) <强>CD28 (37.51)。谱系单克隆抗体： <强>CD4 (L3T4) <强>CD8a (Ly-2) <强>Thy1.2 （CD90.2/53-1.2）， <强>CD45.2 (104). 肠道归巢受体：纯化 <强>CCR9 （CD199/eBioCW-1.2，eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥） <强>a4b7（LPAM-1/DATK3）， <强>同型对照 （IgG2a，k）。皮肤归巢受体： <强>P-选择素-Fc （纯化小鼠P-选择素-IgG融合蛋白，BD Pharmingen，美国加利福尼亚州圣何塞） <强>E-选择素-Fc （重组小鼠E-选择素/Fc融合蛋白，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）及相应的二抗试剂 <强>山羊F(ab’)2 抗人 IgG R-PE （Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德） | |||
| <强>全部-转录 视黄酸（Sigma，美国密苏里州圣路易斯）在制备过程中使用黄色灯泡或间接光源照射下，用无水乙醇或DMSO重悬。将分装样品储存在玻璃小瓶中，置于-80℃保存°C，且始终避光保存。合成 RAR 激动剂：Am80（Wako Chemicals，美国里士满）。 |
参考文献
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Iwata, M. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21, 527-538 (2004).
- Mora, J. R. Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues. J Exp Med. 201, 303-316 (2005).
- Mora, J. R. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells. Nature. 424, 88-93 (2003).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
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