计数人类神经干细胞

摘要

许多组织培养操作需要了解活细胞的精确数量。本实验方案描述了如何区分活细胞与死细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行定量。尽管本方案以人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的计数为例，但也可适用于其他类型的细胞。

摘要

在许多常规组织培养操作中，例如用于免疫细胞化学染色或细胞转染的细胞铺板，都需要知道特定体积细胞悬液中活细胞的精确数量。本方案描述了一种简单快速的方法，通过血细胞计数板区分活细胞与死细胞，并对细胞浓度和总细胞数进行定量。该操作首先需要将细胞从生长表面脱离，并重新悬浮于培养基中。随后，将细胞悬液用台盼蓝溶液稀释（理想情况下稀释至每个四分之一计数区含有20–50个细胞），然后加入血细胞计数板中。最后，取多个随机选择的四分之一计数区中活细胞数的平均值，除以一个1 mm²四分之一区的体积（0.1 μl），再乘以稀释倍数，即可得到每微升（μl）中的细胞数量。将该细胞浓度乘以总体积（μl），即可获得细胞总数。本方案以人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）为例进行计数，但也适用于多种其他类型的细胞。

方案

人神经干细胞传代

注意：请参阅 JoVE 文章《人神经干细胞的传代》，了解如何解离和重悬细胞。https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

准备用于计数的细胞悬液

1. 取25 µl的0.4%台盼蓝溶液和20 µl细胞培养基，加入一个离心管中。
2. 轻轻敲击含有已知体积培养基中细胞的离心管，使细胞重悬并形成均匀的细胞悬液。取5 µl细胞悬液加入上一步的离心管中。此步骤将细胞浓度稀释了10倍。
3. 将盖玻片盖在血细胞计数板上，然后加入约11–12 µl细胞悬液。
   
   
   
   

在血细胞计数板中计数细胞

1. 在相差显微镜下观察血细胞计数板的整个网格。聚焦于网格中的一个象限（例如红色标记的象限）。
   
   
   
   
2. 死亡或濒死细胞由于细胞膜受损，无法排除台盼蓝染料，因此呈现蓝色。活细胞不会呈现蓝色，在相差显微镜下周围可见一圈明亮的“光晕”（即“相差明亮”）。
3. 计数一个象限内的活细胞数量（面积为1 mm²）。也可通过将活细胞数除以细胞总数来确定细胞活力。随机计数3–4个象限中的细胞，计算每个象限的平均细胞数。由于每个象限的体积已知为10^-4 ml 或 0.1 µl，因此可据此确定细胞浓度
   
   
   
   
   
   
4. 可使用以下简化公式计算每微升的细胞数（#cells/µl）：
   
   
   
   试管中细胞总数 = 每微升细胞数 × 试管中液体体积（µl）

讨论

本方案描述了一种简单且快速测定多种细胞实验所需细胞浓度的方法。使用步骤3d中所述的快捷方法，可快速、准确地测定特定体积内的细胞浓度和总细胞数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
相差显微镜血细胞计数板	工具	Hausser Scientific	02-671-54	由 Fisher 以所示目录号分销
0.4% 台盼蓝染液	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15250-061	由 Invitrogen 以所示目录号分销