我们介绍了一种用于分析小鼠胚胎肢部皮肤中复杂血管网络形成的全胚免疫组织化学结合多重标记激光扫描共聚焦显微镜技术。
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本文内容
摘要
摘要
对整个血管系统进行成像的全组织免疫组织化学分析，对于理解分支形态发生的细胞机制至关重要。我们已建立肢体皮肤血管模型，用于研究血管发育过程，其中预先存在的原始毛细血管网被重塑为具有层级分支结构的血管网络。利用多种标记的全组织共聚焦显微镜技术，结合特异性荧光标记物，可有效成像完整的血管及其细胞组分，包括内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞。结合遗传学研究，该肢体皮肤血管模型的进展加深了我们对血管发育与模式形成的分子机制的理解。该模型已被用于研究外周神经如何为动脉的分化与模式形成提供空间模板。本视频文章介绍了一种简单且可靠的染色方案，使用血管特异性抗体和荧光二抗对完整血管进行染色，适用于具有血管化的胚胎器官，使我们能够追踪血管发育过程。
方案
1. 收集小鼠胚胎肢芽皮肤（E13.5～E17.5）
- 采用批准的程序处死已交配的雌性小鼠。根据我们批准的动物实验方案，通过暴露于CO2处死雌鼠，随后以颈椎脱位确认死亡。将动物置于吸水纸巾上，并用挤压瓶中的70% EtOH/H2O充分浸泡消毒。
- 完整取出子宫并置于盛有冰冻Hanks平衡盐溶液（HBSS）的100 × 15 mm培养皿中，以洗去血液。
- 分离并解剖胚胎，去除胚胎表面极薄的羊膜。
- （可选）若需对每个胚胎进行基因型鉴定，可在35 × 10 mm培养皿中单独解剖胚胎。将解剖所得尾尖组织转移至0.2 ml PCR管中用于基因分型。
- 用环形镊子剪下胚胎前肢，并将其转移至含有2 ml冰冻新鲜4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板中。
- 在4°C下，于Nutator混合仪上轻柔振荡固定前肢过夜。
- 次日，吸除PFA溶液，并在室温下用2 ml PBS在Nutator混合仪上轻柔振荡洗涤三次，每次5分钟。
- 将前肢转移至100%甲醇（MeOH）中，储存于-20°C酶标专用冷冻冰箱（具备精确温控且无自动除霜功能的冰箱）。表1所列的一抗在经100% MeOH处理后仍可有效工作。
- 使用精细镊子剥离前肢皮肤。当皮肤脱水后，应易于与肢体分离。首先将前肢腹侧（掌侧）朝上放置。然后用精细镊子按视频所示方式剪开皮肤。接着....
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讨论
血管系统在胚胎发生期间的器官发育以及成体器官的维持和生殖功能中至关重要，因为它为器官提供充足的氧气和营养物质。通过血管生成，由预先存在的毛细血管网络重构形成高度分支且具有层级结构的复杂多步骤过程，从而建立完善的血管网络。尽管已有大量研究证明多种分子参与这些过程，但器官或其组分如何提供信号以促进包括内皮细胞分化和血管分支模式形成在内的血管发育逐步过程，目前尚不清楚。为解决这一问题，需要合适的具有血管化的器官模型，以便能够追踪血管发育的过程。利用功能获得性和功能缺失性遗传操作的肢体皮肤血管模型，可实现对血管发育的高分辨率分析。
本文介绍了一种详细的实验方案，包括小鼠胚胎前肢的解剖、全组织免疫组织化学染色以及共聚焦显微镜观察，该方案在本实验室常规用于分析肢体皮肤的血管生成和淋巴管生成。该方案结果可重复，且无论是早期还是晚期胚胎肢体皮肤的完整血管系统均可通过共聚焦显微镜清晰成像。此方法同样适用于成年小鼠耳部皮肤血管系统的观察（Y.M. 和 K. Perkins，未发表数据）。然而，若要进一步研究血管生长与重塑过程的动态成像，具有荧光标记血管的其他动物模型（如斑马鱼）则可用于高分辨率的活体血.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 K. Gill 在小鼠繁育与饲养以及实验室管理方面提供的协助。同时感谢 Mukoyama 实验室成员提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院院内研究计划提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
抗体 泛内皮细胞标志物 <表格 边框="1"> | ||||
| 抗体 | 物种 | 公司 | 目录编号 # | 工作条件 |
| PECAM-1 | 亚美尼亚仓鼠（M） | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 稀释#1 |
| PECAM-1 | 大鼠（M） | BD | 553369 | 1:300 稀释度 |
| VEGFR2 | 大鼠（M） | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 稀释 |
| CD34 | 大鼠（M） | eBioscience | 13-0341 | 1:300 稀释 |
| IV型胶原蛋白 | 兔（P） | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 稀释度#2 |
动脉内皮细胞标志物
<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 Neuropilin1 兔（P） Alex Kolodkin’s 实验室#3 1:3000 稀释度 Unc5H2 山羊（P） R&&D AF1006 1:200 稀释静脉内皮细胞标志物
<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号# 工作条件 EphB4 山羊（P） R&发育与分化 AF446 1:100 稀释淋巴管内皮细胞标志物
<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 LYVE-1#4 兔 (P) Abcam ab14917 1:200 稀释 LYVE-1#4 大鼠（M） MBL D225-3 1:200 稀释 Prox-1 兔 (P) Chemicon AB5475 1:1000 稀释 Prox-1 山羊（P） R&&D AF2727 1:50 稀释 Neuropilin2 兔 (P) 细胞信号传导 3366 1:100 稀释 Podoplanin 叙利亚仓鼠（M） 杂交瘤库 8.1.1 1:200 稀释度平滑肌细胞/周细胞标志物
<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 αSMA-Cy3 小鼠 (M)#5 Sigma c-6198 1:500 稀释度#6 NG2 兔（P） Chemicon AB5320 1:200 稀释 SM22α 兔 (P) Abcam ab14106 1:200 稀释血管特异性抗体GFP 报告基因
<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 GFP 兔 (P) Invitrogen A11122 1:300 稀释度 GFP 大鼠（M） Nacalai Tesque 04404-84 1:1000 稀释 GFP 鸡 (P) Chemicon P42212 1:300 稀释度血管特异性抗体 LacZ 报告基因
<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 β-gal 兔（P） MP Biomedical 55976 1:5000 稀释度 β-gal 山羊（P） AbD Serotec 4600-1409 1:500 稀释度 β-gal 鸡 (P) Abcam ab9361 1:200 稀释周围轴突抗体
<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 2H3 小鼠 (M)#7 杂交瘤库 2H3 1:200 稀释 Tuj1 小鼠 (M)#8 科文斯 MMS-435P 1:500 稀释度 Peripherin 兔 (P) Chemicon AB1530 1:1000 稀释迁移中的施万细胞抗体
<表格 边框="1"> BFABP 兔 (P) 托马斯·Müller’s 实验室#9 1:3000 稀释度(P)：多克隆抗体，(M)：单克隆抗体
#1：应使用山羊抗叙利亚仓鼠-Cy3（Jackson ImmunoResearch 127-165-160）抗体作为二抗。
#2：胶原蛋白IV抗体可用于检测血管 原位 杂交。
#3：Neuropilin1 抗体由 Alex Kolodkin 惠赠’s 实验室，约翰斯·霍普金斯大学。抗人 Neuropilin1 羊多克隆抗体可从 R 获取&D (AF3870)，尽管我们尚未对其进行测试。
#4：LYVE-1 抗体还可检测胚胎皮肤中的一部分巨噬细胞。
#5：抗-αSMA 抗体为小鼠 IgG2a 单克隆抗体。
#6：Cy3偶联的 αSMA 抗体与针对其他一抗的二抗在室温下共同孵育 1 小时。
#7：2H3 抗体是一种针对神经丝蛋白的小鼠 IgG1 单克隆抗体。
#8：Tuj1 抗体是一种针对神经元特异性 III 类 β-微管蛋白的小鼠 IgG2a 单克隆抗体。
#9：BFABP（脑特异性脂肪酸结合蛋白）抗体由 Thomas M 亲切提供üller’s 实验室，马克斯-德尔布吕克ück-分子医学中心
参考文献
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J.
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