胚胎肢皮肤血管系统的整体免疫组织化学分析：研究胚胎血管分支形态发生的一种模型系统

摘要

我们介绍了一种用于分析小鼠胚胎肢部皮肤中复杂血管网络形成的全胚免疫组织化学结合多重标记激光扫描共聚焦显微镜技术。

摘要

对整个血管系统进行成像的全组织免疫组织化学分析，对于理解分支形态发生的细胞机制至关重要。我们已建立肢体皮肤血管模型，用于研究血管发育过程，其中预先存在的原始毛细血管网被重塑为具有层级分支结构的血管网络。利用多种标记的全组织共聚焦显微镜技术，结合特异性荧光标记物，可有效成像完整的血管及其细胞组分，包括内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞。结合遗传学研究，该肢体皮肤血管模型的进展加深了我们对血管发育与模式形成的分子机制的理解。该模型已被用于研究外周神经如何为动脉的分化与模式形成提供空间模板。本视频文章介绍了一种简单且可靠的染色方案，使用血管特异性抗体和荧光二抗对完整血管进行染色，适用于具有血管化的胚胎器官，使我们能够追踪血管发育过程。

方案

1. 收集小鼠胚胎肢芽皮肤（E13.5～E17.5）

1. 采用批准的程序处死已交配的雌性小鼠。根据我们批准的动物实验方案，通过暴露于CO₂处死雌鼠，随后以颈椎脱位确认死亡。将动物置于吸水纸巾上，并用挤压瓶中的70% EtOH/H₂O充分浸泡消毒。
2. 完整取出子宫并置于盛有冰冻Hanks平衡盐溶液（HBSS）的100 × 15 mm培养皿中，以洗去血液。
3. 分离并解剖胚胎，去除胚胎表面极薄的羊膜。
4. （可选）若需对每个胚胎进行基因型鉴定，可在35 × 10 mm培养皿中单独解剖胚胎。将解剖所得尾尖组织转移至0.2 ml PCR管中用于基因分型。
5. 用环形镊子剪下胚胎前肢，并将其转移至含有2 ml冰冻新鲜4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板中。
6. 在4°C下，于Nutator混合仪上轻柔振荡固定前肢过夜。
7. 次日，吸除PFA溶液，并在室温下用2 ml PBS在Nutator混合仪上轻柔振荡洗涤三次，每次5分钟。
8. 将前肢转移至100%甲醇（MeOH）中，储存于-20°C酶标专用冷冻冰箱（具备精确温控且无自动除霜功能的冰箱）。表1所列的一抗在经100% MeOH处理后仍可有效工作。
9. 使用精细镊子剥离前肢皮肤。当皮肤脱水后，应易于与肢体分离。首先将前肢腹侧（掌侧）朝上放置。然后用精细镊子按视频所示方式剪开皮肤。接着围绕整个肢体进行解剖，轻柔剥离皮肤，避免造成任何损伤。

2. 肢体皮肤的全组织免疫组织化学染色

1. 将肢部皮肤置于5 ml聚丙烯圆底管中，依次在甲醇/PBT（PBS + 0.2% Triton X-100）梯度溶液（75%、50%、25%）中孵育，每步5分钟，以重新水化组织。注意更换溶液时应小心操作，避免损伤肢部皮肤。
2. 在PBT中于室温下使用Nutator混合器轻柔振荡洗涤两次，每次5分钟。
3. 使用10%山羊血清/PBS + 0.2% TX100封闭缓冲液（用于山羊来源的二抗）或10%驴血清/PBS + 0.2% TX100封闭缓冲液（用于驴来源的二抗），在室温下于Nutator混合器上轻柔振荡封闭肢部皮肤2小时。
4. 将肢部皮肤转移至35 × 10 mm培养皿中，用环形镊子将其移入含有800 μl一抗（按表格中所列适当稀释度）的2 ml微量离心管中，封闭缓冲液为10%山羊血清/PBS + 0.2% TX100或10%驴血清/PBS + 0.2% TX100。于4°C在Nutator混合器上轻柔振荡孵育过夜。注意：可同时使用来自不同物种的多种一抗（例如大鼠单克隆抗体 + 兔多克隆抗体）。
5. 次日，将肢部皮肤转移至35 × 10 mm培养皿中，用环形镊子将其移入含有4 ml洗涤缓冲液（2%山羊血清/PBS + 0.2% TX100或2%驴血清/PBS + 0.2% TX100）的5 ml聚丙烯圆底管中。
6. 在室温下于Nutator混合器上轻柔振荡，用洗涤缓冲液洗涤五次，每次15分钟。
7. 将肢部皮肤转移至35 × 10 mm培养皿中，用环形镊子将其移入含有800 μl二抗的2 ml微量离心管中，封闭缓冲液为10%山羊血清/PBS + 0.2% TX100或10%驴血清/PBS + 0.2% TX100。通常使用Jackson ImmunoResearch公司（Cy3、Cy5，1:300稀释）或Invitrogen公司（Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 633，1:250稀释）的二抗。使用0.22 μm PVDF膜注射器滤器过滤二抗溶液，以去除聚集的颗粒。于室温下在Nutator混合器上轻柔振荡，在避光或铝箔包裹条件下孵育1小时。注意：可同时使用来自不同物种的多种荧光标记二抗。
8. 将肢部皮肤转移至35 × 10 mm培养皿中，用环形镊子将其移入含有4 ml洗涤缓冲液（2%山羊血清/PBS + 0.2% TX100或2%驴血清/PBS + 0.2% TX100）的5 ml聚丙烯圆底管中。在避光或铝箔包裹条件下，于室温下在Nutator混合器上轻柔振荡洗涤五次，每次15分钟。
9. （细胞核复染可选步骤）在避光或铝箔包裹条件下，将肢部皮肤与4 ml洗涤缓冲液（2%山羊血清/PBS + 0.2% TX100或2%驴血清/PBS + 0.2% TX100）及To-Pro-3（Invitrogen T3605，1:3000稀释）于室温下在Nutator混合器上轻柔振荡孵育10分钟。随后，在避光或铝箔包裹条件下，用4 ml洗涤缓冲液（2%山羊血清/PBS + 0.2% TX100或2%驴血清/PBS + 0.2% TX100）洗涤三次，每次5分钟。注意：To-Pro-3在特定发射波长（HeNe 633 nm激发）下可观察到强而特异的细胞核染色。

3. 将肢体皮肤切片装载到载玻片上

1. 将肢体皮肤置于35 × 10 mm的培养皿中。在体视显微镜下使用精细镊子，在低光照条件下清除皮肤内层的灰尘、结晶和纤维，以避免过度光漂白。
2. 用环形镊子将肢体皮肤转移至带粘附性的显微镜载玻片上。将皮肤内层朝上放置于载玻片上（即朝向盖玻片）。使用精细镊子小心展平皮肤，并用吸水纸（Kimwipe）去除残留的洗涤缓冲液。
3. 用抗荧光淬灭封片剂封片，避免产生气泡。我们使用25"×25"的盖玻片。在避光的平坦表面上固化（例如，使用ProLong Gold试剂封片的样品需在室温下避光放置过夜后再观察）。如需长期保存，应将盖玻片密封于载玻片上，并在4°C下储存。

4. 共聚焦显微镜

1. 为荧光染料设置适当的激光器。我们使用徕卡 TCS SP5 共聚焦显微镜，配备三种激光源：氩离子 488 nm（用于 Alexa Fluor 488 和 GFP）、DPSS 561 nm（用于 Alexa Fluor 568 和 Cy3）以及 HeNe 633 nm（用于 Alexa Fluor 633、Cy5 和 To-Pro-3）。
2. 使用逐帧扫描工具以避免或减少串扰，防止双标或三标样品中所有染料同时被激发。在逐帧扫描模式下，图像将按顺序依次采集。
3. 有关荧光染料及激发激光器的更多一般性信息，可参见 Hibbs（2004）所著《生物学家的共聚焦显微镜》。

5. 代表性结果

在E15.5小鼠前肢皮肤中进行整体三重标记共聚焦免疫荧光显微镜检测，使用针对泛内皮细胞标志物PECAM-1（图1A-C，D中蓝色）、神经丝标志物2H3（图1A中绿色）以及平滑肌细胞标志物αSMA（图1A、B中红色）的抗体，结果显示αSMA⁺动脉呈现出特征性的分支模式，并与肢体皮肤中的2H3⁺外周神经平行排列。除了用于研究血管分支外，该肢体皮肤血管模型还可利用针对淋巴管内皮细胞标志物LYVE-1（图1D、E中红色）和Neuropilin2（NRP2）（图1D、F中绿色）的抗体来研究淋巴管分支的模式形成。

图1. （A-C）在胚胎肢体皮肤中，动脉与外周神经平行排列。采用针对泛内皮细胞标志物PECAM-1（A-C，蓝色）、神经丝标志物2H3（A，绿色）和血管平滑肌细胞标志物αSMA（A和B，红色）的抗体进行整体三重标记共聚焦免疫荧光显微成像。在E15.5时期，2H3⁺外周神经（空心箭头）与被αSMA⁺平滑肌细胞包绕的动脉（箭头）相关联。（D-F）胚胎肢体皮肤中的淋巴管系统。采用针对泛内皮细胞标志物PECAM-1（D，蓝色）、淋巴内皮细胞标志物LYVE-1（D和E，红色）以及Neuropilin2（NRP2）（D和F，绿色）的抗体进行三重标记共聚焦免疫荧光显微成像。淋巴管可由LYVE-1和NRP2共同显示，而LYVE-1也在部分巨噬细胞中表达（空心箭头）。比例尺：100μm。

讨论

血管系统在胚胎发生期间的器官发育以及成体器官的维持和生殖功能中至关重要，因为它为器官提供充足的氧气和营养物质。通过血管生成，由预先存在的毛细血管网络重构形成高度分支且具有层级结构的复杂多步骤过程，从而建立完善的血管网络。尽管已有大量研究证明多种分子参与这些过程，但器官或其组分如何提供信号以促进包括内皮细胞分化和血管分支模式形成在内的血管发育逐步过程，目前尚不清楚。为解决这一问题，需要合适的具有血管化的器官模型，以便能够追踪血管发育的过程。利用功能获得性和功能缺失性遗传操作的肢体皮肤血管模型，可实现对血管发育的高分辨率分析。

本文介绍了一种详细的实验方案，包括小鼠胚胎前肢的解剖、全组织免疫组织化学染色以及共聚焦显微镜观察，该方案在本实验室常规用于分析肢体皮肤的血管生成和淋巴管生成。该方案结果可重复，且无论是早期还是晚期胚胎肢体皮肤的完整血管系统均可通过共聚焦显微镜清晰成像。此方法同样适用于成年小鼠耳部皮肤血管系统的观察（Y.M. 和 K. Perkins，未发表数据）。然而，若要进一步研究血管生长与重塑过程的动态成像，具有荧光标记血管的其他动物模型（如斑马鱼）则可用于高分辨率的活体血...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体 泛内皮细胞标志物 <表格 边框="1">
抗体	物种	公司	目录编号 #	工作条件
PECAM-1	亚美尼亚仓鼠（M）	Chemicon	MAB1398Z	1:100 稀释#1
PECAM-1	大鼠（M）	BD	553369	1:300 稀释度
VEGFR2	大鼠（M）	eBioscience	14-5821-82	1:200 稀释
CD34	大鼠（M）	eBioscience	13-0341	1:300 稀释
IV型胶原蛋白	兔（P）	AbD Serotec	2150-1470	1:300 稀释度#2

动脉内皮细胞标志物

<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 Neuropilin1 兔（P） Alex Kolodkin’s 实验室^#3 1:3000 稀释度 Unc5H2 山羊（P） R&&D AF1006 1:200 稀释

静脉内皮细胞标志物

<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号# 工作条件 EphB4 山羊（P） R&发育与分化 AF446 1:100 稀释

淋巴管内皮细胞标志物

<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 LYVE-1^#4 兔 (P) Abcam ab14917 1:200 稀释 LYVE-1^#4 大鼠（M） MBL D225-3 1:200 稀释 Prox-1 兔 (P) Chemicon AB5475 1:1000 稀释 Prox-1 山羊（P） R&&D AF2727 1:50 稀释 Neuropilin2 兔 (P) 细胞信号传导 3366 1:100 稀释 Podoplanin 叙利亚仓鼠（M） 杂交瘤库 8.1.1 1:200 稀释度

平滑肌细胞/周细胞标志物

<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 αSMA-Cy3 小鼠 (M)^#5 Sigma c-6198 1:500 稀释度^#6 NG2 兔（P） Chemicon AB5320 1:200 稀释 SM22α 兔 (P) Abcam ab14106 1:200 稀释

血管特异性抗体GFP 报告基因

<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 GFP 兔 (P) Invitrogen A11122 1:300 稀释度 GFP 大鼠（M） Nacalai Tesque 04404-84 1:1000 稀释 GFP 鸡 (P) Chemicon P42212 1:300 稀释度

血管特异性抗体 LacZ 报告基因

<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 β-gal 兔（P） MP Biomedical 55976 1:5000 稀释度 β-gal 山羊（P） AbD Serotec 4600-1409 1:500 稀释度 β-gal 鸡 (P) Abcam ab9361 1:200 稀释

周围轴突抗体

<表格 边框="1"> 抗体 物种 公司 目录编号 # 工作条件 2H3 小鼠 (M)^#7 杂交瘤库 2H3 1:200 稀释 Tuj1 小鼠 (M)^#8 科文斯 MMS-435P 1:500 稀释度 Peripherin 兔 (P) Chemicon AB1530 1:1000 稀释

迁移中的施万细胞抗体

<表格 边框="1"> BFABP 兔 (P) 托马斯·Müller’s 实验室^#9 1:3000 稀释度

(P)：多克隆抗体，(M)：单克隆抗体

#1：应使用山羊抗叙利亚仓鼠-Cy3（Jackson ImmunoResearch 127-165-160）抗体作为二抗。

#2：胶原蛋白IV抗体可用于检测血管 原位 杂交。

#3：Neuropilin1 抗体由 Alex Kolodkin 惠赠’s 实验室，约翰斯·霍普金斯大学。抗人 Neuropilin1 羊多克隆抗体可从 R 获取&D (AF3870)，尽管我们尚未对其进行测试。

#4：LYVE-1 抗体还可检测胚胎皮肤中的一部分巨噬细胞。

#5：抗-αSMA 抗体为小鼠 IgG2a 单克隆抗体。

#6：Cy3偶联的 αSMA 抗体与针对其他一抗的二抗在室温下共同孵育 1 小时。

#7：2H3 抗体是一种针对神经丝蛋白的小鼠 IgG1 单克隆抗体。

#8：Tuj1 抗体是一种针对神经元特异性 III 类 β-微管蛋白的小鼠 IgG2a 单克隆抗体。

#9：BFABP（脑特异性脂肪酸结合蛋白）抗体由 Thomas M 亲切提供üller’s 实验室，马克斯-德尔布吕克ück-分子医学中心